Agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal para investigar la formación de tejido del bazo murino
28 de junio de 2024
Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.
El objetivo general de este protocolo es agregar y encerrar células dentro de una matriz semisólida. Los agregados celulares incrustados se pueden utilizar aguas abajo en cultivos in vitro tridimensionales o como vehículo para experimentos de trasplante in vivo. La principal ventaja de este método es que utiliza una metodología y un equipo sencillos para lograr la agregación celular.
También se puede aplicar a una variedad de tipos y números de celdas. Esta técnica ha revelado un tipo específico de célula que se requiere para que el bazo se regenere. Podría descubrir más reguladores de la regeneración del tejido del bazo o servir como plataforma para estudios más amplios de ingeniería de tejidos.
Comience enfriando previamente una caja de puntas de pipeta de 200 microlitros dentro de un congelador a menos 20 grados centígrados. A continuación, sumerja Parafilm en etanol al 80% durante 10 minutos, seguido de un lavado de 10 minutos en PBS. Para preparar la solución celular, alícuota el número de célula deseado en un tubo cónico de 14 mililitros.
Centrifugar las células a 200 g y 4 grados centígrados durante 5 minutos. A continuación, aspire con cuidado el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 20 microlitros de volumen. A continuación, el gránulo de la célula puede resuspenderse en el volumen sobrenadante restante.
Con una punta de pipeta preenfriada, aspire 2 microlitros de Matrigel helado. Gire suavemente y expulse para retirar la punta de la pipeta. Estire una tira preesterilizada de Parafilm y colóquela sobre el extremo de la punta de la pipeta, teniendo cuidado de no perforar la película.
Continúe envolviendo el Parafilm alrededor del costado para asegurarse de que la punta esté sellada. A continuación, coloque la solución celular suavemente sobre el Matrigel. Deje la punta de la pipeta en hielo y prepare un tubo cónico de 14 mililitros con un tubo de racimo de 1,2 mililitros colocado en su interior.
A continuación, la punta de la pipeta puede insertarse dentro de la configuración del tubo anidado y centrifugarse a 400 g y 4 grados centígrados durante 5 minutos. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 15 minutos. El tubo se puede colocar en hielo hasta que se requiera más.
Retire con cuidado el Parafilm de la punta de la pipeta, luego inserte un émbolo de alambre delgado y expulse el tapón Matrigel al medio de cultivo de tejidos. Las células agregadas se pueden cultivar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Afeita el pelaje con una maquinilla eléctrica y frota la piel con etanol al 80%.
Hacer una incisión de dos centímetros en la piel perpendicular a la columna vertebral y exponer la pared peritoneal. Luego se hace una segunda incisión más pequeña en la pared peritoneal por encima del riñón. Aplicar presión y exteriorizar el riñón.
Asegúrese de que el riñón se mantenga húmedo mediante la aplicación regular de PBS estéril. Pellizque la cápsula del riñón con un par de pinzas ultrafinas y, con un segundo par, rasgue suavemente en direcciones opuestas. Separe cuidadosamente la membrana de la cápsula del parénquima renal.
Levante la cápsula de riñón con un par de pinzas y deslice lentamente la punta de la pipeta a través de la abertura. Inserte suavemente un émbolo de alambre en la punta de la pipeta y expulse el tapón Matrigel. Humedecer el riñón con PBS y volver a internalizarlo en la cavidad peritoneal.
Cierre la pared peritoneal con suturas 5-O-Vicryl y cierre la incisión cutánea con un aplicador AutoClip y dos pinzas para heridas de 9 milímetros. Un paso clave en este protocolo es la agregación de células dentro de una matriz semisólida. El posicionamiento de la capa intermedia se logra a través de velocidades de centrifugación óptimas.
Las velocidades más altas impulsan las células hasta la punta de la pipeta, mientras que las velocidades insuficientes impiden el movimiento de las células a través de la matriz. Después de la solidificación, la construcción Matrigel puede ser expulsada de la punta de la pipeta. Las construcciones estromales del bazo que se cultivan in vitro forman estructuras organoides esféricas tridimensionales.
Los organoides muestran una estructura no hueca con células presentes en todo el diámetro del tejido. Están compuestas por tres amplias poblaciones celulares, que incluyen glóbulos blancos, glóbulos rojos y células estromales y endoteliales no hemopoyéticas. Los constructos también se pueden trasplantar debajo de la cápsula renal para estudios de regeneración de tejidos.
Después de cuatro semanas, se puede observar la estructura organizada del tejido del bazo, que incluye arteriolas centrales, folículos de células B, células reticulares fibroblásticas, células mieloides de pulpa roja, macrófagos metalófilos de la zona marginal, sinusoides de pulpa roja y redes de células dendríticas foliculares, zona de células T, macrófagos de pulpa roja y células reticulares de la zona marginal. Al intentar la agregación y encapsulación celular, es importante recordar trabajar rápidamente y mantener todos los materiales en hielo. El paso más importante para los trasplantes es expulsar el tapón Matrigel mientras se retira la punta de la pipeta del riñón.
Se debe tener cuidado de no perforar la membrana de la cápsula ni de romper el parénquima renal. Este protocolo se utilizó para investigar los requisitos de dos poblaciones de células estromales en la regeneración del tejido del bazo. En este experimento representativo, solo los agregados agotados de células MAdCAM positivas para el receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas no lograron iniciar el crecimiento del tejido, lo que sugiere que esta población celular en particular es esencial para que el bazo se regenere.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para la agregación y encapsulación de células del bazo dentro de una matriz de membrana basal semisólida. Esta técnica puede utilizarse para cultivo tridimensional con el fin de estudiar el desarrollo de organoides o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Agregación celular
- Ingeniería de tejidos
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- El protocolo permite el encapsulamiento de células en una matriz semisólida.
- Puede aplicarse a diversos tipos y números de células.
- Este método ha revelado tipos celulares específicos necesarios para la regeneración del bazo.
- Sirve como una plataforma para estudios más amplios de ingeniería de tejidos.
Objetivo del estudio
- Agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz de membrana basal.
- Facilitar el cultivo tridimensional in vitro.
- Permitir experimentos de trasplante in vivo.
Métodos Utilizados
- Agregación de células del bazo.
- Encapsulación dentro de una matriz de membrana basal semisólida.
- Uso de una metodología y equipo sencillos.
- Aplicación en diversos tipos celulares.
Resultados principales
- Agregación y encapsulamiento exitosos de células del bazo.
- Identificación de tipos celulares específicos necesarios para la regeneración del bazo.
- Potencial para descubrir reguladores adicionales de la regeneración de tejidos.
- Establecimiento de una plataforma para estudios de ingeniería de tejidos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método sencillo para la agregación celular.
- Tiene implicaciones para comprender la regeneración del tejido esplénico.
- Esta técnica podría mejorar la investigación futura en ingeniería de tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal permite la investigación controlada de los requisitos celulares para la formación de tejido esplénico murino, apoyando la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. Esta plataforma ofrece una confianza predictiva para identificar poblaciones esenciales de células estromales en la regeneración tisular, informando directamente la validación de dianas y las estrategias de ingeniería de tejidos. La adaptabilidad del método tanto al cultivo de organoides in vitro como al trasplante in vivo lo posiciona como una capacidad reutilizable para carteras de I+D en medicina regenerativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos celulares que subyacen a la regeneración del tejido esplénico.
- Apoya la validación funcional de poblaciones de células estromales fundamentales para la organogénesis.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante el aislamiento y la prueba de tipos celulares específicos.
- Proporciona una plataforma para estudios basados en hipótesis sobre los requisitos para la formación de tejidos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas validados de organoides tridimensionales para análisis posteriores.
- Normaliza la encapsulación y la agregación para obtener construcciones de tejidos reproducibles.
- Genera resultados cuantitativos sobre la estructura del organoide y la composición celular.
- Permite la evaluación escalable de las contribuciones de las poblaciones celulares a la formación del tejido.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Permite alinear modelos in vitro e in vivo para lograr continuidad traslacional en ingeniería de tejidos.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de estrategias regenerativas basado en resultados funcionales del tejido.
- Proporciona un sistema relevante para la enfermedad en el estudio de la regeneración de órganos inmunitarios.
- Facilita la identificación de biomarcadores traslacionales vinculados a la formación exitosa de tejidos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de encapsulación y agregación conecta el descubrimiento inicial, la selección y la validación preclínica al permitir la manipulación y evaluación controladas de poblaciones celulares en modelos de organoides y de trasplante.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los factores celulares que impulsan la regeneración del tejido esplénico.
- Tamizaje: Proporciona construcciones de organoides reproducibles y cuantitativas para estudios comparativos.
- Análisis: Ofrece resultados medibles sobre la arquitectura del tejido y las contribuciones de los tipos celulares.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos in vitro con la formación de tejidos in vivo y sus resultados funcionales.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma modular adaptable a diversos programas de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en las poblaciones celulares diana para la regeneración de tejidos.
- Valor operativo: Estandariza la encapsulación y la agregación para obtener flujos de trabajo reproducibles.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o no en el desarrollo de estrategias regenerativas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de los enfoques de ingeniería de tejidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de aislamiento celular, encapsulación y cultivo de organoides.
- Necesita acceso a equipos de centrifugación, manipulación estéril e instrumentación para trasplantes.
- Exige una estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad entre experimentos.
- Adaptable a diversos tipos celulares y modelos de tejidos mediante la optimización del protocolo.
- Es fundamental manejar con cuidado para evitar daños en el tejido u órgano durante los pasos de trasplante.
