Name: Extracción de ADN y comparación entre muestras de moscas necrófilas viejas y frescas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprende a extraer ADN de moscas necrófilas frescas y viejas usando un kit de prueba sanguínea modificado. Este método económico facilita análisis de biología molecular y forense.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82060341,81560304) y del Proyecto de Investigación Científica de la Plataforma de Innovación Académica de la provincia de Hainan (YSPTZX202134).

NOTA: Se utilizaron un total de cinco muestras de C. megacephala en este protocolo: tres muestras frescas (Fresh 1, Fresh 2 y Fresh 3), una muestra almacenada en alcohol durante 2 años (Old 1) y una muestra almacenada en almacenamiento sellado en seco durante 2 años protegida de la luz solo (Old 2). Las muestras deben etiquetarse de acuerdo con los requisitos experimentales.
1. Almacenamiento general de muestras y preparaciones
<ol><li>Selección y preparación de muestras NOTA: Asegúrese de trabajar en la campana extractora cuando aplique acetato de etilo para eliminar moscas necrófagas. Retire el líquido de la superficie de la mosca antes de pesarla.<ol><li>Muestras frescas: Coloque tres muestras de mosca recolectadas en viales de gas después de matarlas con acetato de etilo. Pesa y nombra las muestras como Fresh 1, Fresh 2 y Fresh 3 y utilízalas inmediatamente en los experimentos. NOTA: Las muestras frescas de mosca en este protocolo tenían masas de 56,8 mg, 49,3 mg y 52,1 mg.</li>
		<li>Muestra antigua 1: Extraiga las muestras de moscas muertas por acetato de etilo y almacenadas en tubos de centrífuga llenos de alcohol durante 2 años en una contención hermética, protegidas de la luz a temperatura ambiente. Pesar la muestra después de adsorber el líquido de la superficie con papel de filtro; llámalo Viejo 1. NOTA: La masa de Old 1 fue de 42,3 mg en este protocolo.</li>
		<li>Muestra antigua 2: Extraiga la muestra de mosca muerta por acetato de etilo y almacenada en un tubo de centrífuga durante 2 años en una contención hermética, protegida de la luz a temperatura ambiente. Pesa y llámalo Viejo 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación antes de la extracción<ol><li>Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un recipiente de acero inoxidable; Espere hasta que todo el nitrógeno líquido se haya evaporado.</li>
		<li>Coloque una muestra de mosca en el recipiente; Vierta el nitrógeno líquido lentamente para evitar que el nitrógeno líquido salpique e impacte en la muestra de insecto.</li>
		<li>Congele las muestras en nitrógeno líquido. Retire las muestras después de que el nitrógeno líquido se evapore.</li>
		<li>Separe el tórax individualmente, colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml y córtelo en rodajas lo más pequeñas posibles. NOTA: Corte la muestra en pedazos pequeños para que pueda cortarse por completo y el ADN se pueda liberar en grandes cantidades.</li>
		<li>Repita los pasos anteriores para cada mosca, congele individualmente y luego retírela a un nuevo tubo de centrífuga para evitar la contaminación cruzada del ADN.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extracción de ADN
NOTA: Todas las etapas de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente (15-25 °C) en una microcentrífuga. Todos los pasos deben realizarse en estricto cumplimiento de los principios de asepsia y para evitar la contaminación cruzada.
<ol><li>Lisis de tejidos<ol><li>Añada 180 μl de tampón de lisis tisular a un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga una muestra recortada.</li>
		<li>Añadir 20 μL de proteinasa K. Mezclar bien mediante vórtice a 3 000 rpm durante 10 s e incubar a 56 °C hasta que los tejidos del insecto estén completamente lisados. NOTA: Agregue más proteinasa K si el tejido no se digiere completamente. La lisis generalmente se completa en 1-3 h, también puede extender el tiempo de lisis durante la noche.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitación de ADN<ol><li>Vórtice a 3.000 rpm durante 15 s. Añada 200 μL de tampón de lisis a la muestra y mezcle bien mediante vórtice a 3.000 rpm durante 15 s.</li>
		<li>Añadir 200 μL de etanol (96-100%) y mezclar de nuevo a fondo mediante vórtice a 3.000 rpm durante 15 s. NOTA: El tampón de lisis y el etanol se pueden agregar previamente en un solo paso para ahorrar tiempo. Se puede formar un precipitado blanco con la adición de tampón de lisis y etanol.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipetear la mezcla en la columna de adsorción de ADN colocada en un tubo de recolección de 2 mL. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Deseche el flujo y el tubo de recolección.</li>
	<li>Coloque la columna de adsorción de ADN del paso anterior en un nuevo tubo de recolección de 2 ml, agregue 500 μL de tampón de eliminación de proteínas y centrifugue a 6,000 × g durante 1 min. Deseche el flujo y el tubo de recolección.</li>
	<li>Transfiera la columna de adsorción de ADN a un nuevo tubo de recolección de 2 mL, agregue 500 μL de tampón de desalinización y centrifugue a 20,000 × g durante 3 min para secar la membrana de la columna de adsorción de ADN. Deseche el flujo y el tubo de recolección. NOTA: Este paso de centrifugación asegura la eliminación de cualquier etanol residual antes de la siguiente elución. Si hay algún remanente de etanol, centrifugar nuevamente a 20,000 × g durante 1 min.</li>
	<li>Coloque la columna de adsorción de ADN en un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL, pipetee directamente 100 μL de tampón de elución de ADN sobre la membrana de la columna, incube a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego centrifugue a 6.000 × g durante 1 min para eluir. NOTA: La elución con 100 μL (en lugar de 200 μL) aumenta la concentración final de ADN en el eluido, pero también disminuye el rendimiento total de ADN. Para maximizar el rendimiento de ADN, repita la elución una vez como se describe en el paso 2.8.</li>
	<li>Almacene las muestras de ADN a 4 °C (hasta 1 semana) o -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>3. Detección de la concentración de ADN
<ol><li>Determine los valores de OD 260 y OD 280 para comparar la pureza del ADN y la concentración de ácido nucleico mediante un lector de microplacas. Repita tres veces en cada muestra.</li>
	<li>Determine la concentración del ADN extraído mediante un fluorómetro utilizando su kit complementario, con tres repeticiones para cada muestra.<ol><li>Tome 190 μL de solución de trabajo en dos tubos de centrífuga de 0,5 mL, tome 10 μL de cada uno de los Estándar # 1 y 10 μL de la Norma # 2, agréguelos a las soluciones de trabajo y manténgalos alejados de la luz durante no menos de 15 minutos. NOTA: El Estándar #1 y el Estándar #2 están calibrados con precisión para una cierta concentración de ADN. Las soluciones estándar deben configurarse con precisión para garantizar la formación de una curva estándar precisa. El estándar #1 es una muestra de ADN bicatenario (dsDNA) de 0,2 ng/μL; el estándar #2 es de 2.000 ng/μL. La solución de trabajo es un tinte que se une específicamente al dsDNA.</li>
		<li>Tome 2 μL de ADN de prueba y mézclelo con 198 μL de solución de trabajo en un tubo de centrífuga de 0,5 mL, y manténgalo alejado de la luz durante no menos de 15 minutos. NOTA: Si la concentración de ADN es baja, agregue 5 μL de ADN de prueba con 195 μL de solución de trabajo.</li>
		<li>Después de 15 minutos, encienda el instrumento y seleccione Medición de concentración de dsDNA | Largo alcance. Primero, pruebe el Estándar # 1 y luego, el Estándar # 2 para obtener la curva estándar. NOTA: La solución estándar debe utilizarse el mismo día después de su configuración; Dejarlo durante demasiado tiempo dará como resultado un gran error en la curva estándar.</li>
		<li>Coloque las muestras que se van a analizar en los pocillos de ensayo una por una, ajuste el volumen de aumento de ADN a 2 μL, repita la medición tres veces, tome el valor promedio y registre.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR y detección electroforética
NOTA: Se tomó la secuencia del gen de CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondrial con una longitud de 278 pb para la amplificación por PCR con cebador directo C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG, y cebador inverso C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, y luego se realizó electroforesis en gel de agarosa al 2% para verificar el efecto de amplificación y la longitud de los productos de amplificación.
<ol><li>Configure 20 μL del sistema de amplificación de PCR agregando 10 μL de mezcla 2x Taq, 1 μL de cada cebador, 5 μL de ddH2O y 3 μL de ADN moltest; Mezclar bien durante 10 s en una centrífuga.</li>
	<li>Utilice los siguientes parámetros de ciclo de PCR: predesnaturalización a 95 °C durante 10 min; desnaturalización 95 °C durante 30 s, recocido 48 °C durante 30 s, extensión 72 °C durante 45 s durante un total de 40 ciclos; y extensión final 72 °C durante 10 min.</li>
	<li>Someter los productos después de la PCR a una electroforesis en gel de agarosa al 2% y, después de la electroforesis, colocarlos en un sistema de imágenes en gel para su fotoanálisis.</li>
</ol>

Evaluación de la pureza y concentración del ADN en muestras frescas y viejas de moscas necrófilas

<ol><li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+entomology%3A+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li>
<li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li>
<li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia%3A+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li>
<li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li>
<li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li>
<li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li>
<li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants%3A+Retrospective%2C+population+based+diagnostic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214(2021).</li>
<li>Cai, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+availability+of+mitochondrial+DNA+cytochrome+oxidasegene+for+the+distinction+of+forensically+important+flies+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China.</a> Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).</li>
<li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+chitin%2C+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li>
<li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Henan+Univ+Sci+Tech+%28Med+Sci%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li>
<li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699(2011).</li>
<li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients%3A+A+real-world+use+of+genomic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li>
<li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae%2C+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li>
<li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li>
<li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29+with+emphasis+on+DNA+barcoding%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778(2023).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La extracción de ADN es el eslabón más crítico en la identificación molecular de moscas necrófilas, y su método de extracción y la calidad del ADN extraído afectan directamente a la detección posterior. En este experimento, extrajimos con éxito ADN de moscas necrófilas mediante el uso de un kit de sangre común, sin la necesidad de comprar un kit especial de extracción de ADN de insectos, lo que hace que la extracción de ADN de insectos sea más fácil de lograr.
La superficie de las moscas es rica en quitina, especialmente en las etapas larvaria y pupal, donde la quitina epidérmica puede alcanzar el 60-70%, lo que dificulta la extracción de ADN de moscas necrófilas9. Durante el proceso de extracción comprobamos que si la muestra estaba húmeda, aunque la hubiéramos cortado adecuadamente, la muestra permanecía gelatinosa cuando se aplicaba proteinasa K para la digestión. Esto evitó que el líquido añadido volviera a pasar a través de la columna de adsorción. Para resolver este problema, primero aplicamos nitrógeno líquido para congelar rápidamente las muestras y hacer que las moscas fueran quebradizas y fáciles de moler, así como fáciles de digerir por completo. Si no se dispone de nitrógeno líquido para la molienda y aún se debe mejorar la eficiencia de la extracción de ADN, las muestras de mosca pueden colocarse en un área ventilada durante aproximadamente 48 h. Las muestras se pueden dejar secar antes de que se corten adecuadamente y, posteriormente, se extraiga el ADN.
Teniendo en cuenta que la degradación del ADN de las muestras antiguas era una preocupación mayor, se seleccionaron muestras de tórax de mosca para la extracción de ADN en este experimento debido al alto contenido de ADN del tórax. Sin embargo, el uso del tórax es demasiado perjudicial para la integridad morfológica de la mosca para la preservación completa de la evidencia posterior y la necesidad de identificación morfológica. Las muestras son difíciles de extraer cuando el tórax se estaba pudriendo. Si las muestras son frescas, puede ser preferible la extracción de ADN del pie y el ala. El pie y el ala están distribuidos simétrica y bilateralmente, y se pueden conservar características morfológicas más completas después de la extracción de tejido de un lado. Sin embargo, la concentración de ADN extraído del ala y el pie es relativamente baja, lo que es arriesgado para estudios posteriores. Además, las muestras eran pequeñas y se perdían fácilmente10.
Al emplear el kit de extracción de ADN para la extracción de ADN, los valores de OD260/OD280 medidos por el lector de microplacas fueron superiores a 2, excepto para la muestra antigua 2. En primer lugar, se puede determinar que la proteína se eliminó más a fondo, pero puede haber contaminación por ARN, roturas de doble cadena de ADN debido a centrifugación repetida o degradación del ADN en las muestras antiguas11. En segundo lugar, también puede indicar que el alcohol prolonga la conservación del ARN.
La concentración de ADN se calcula a partir del valor OD260 del lector de microplacas, mientras que el fluorímetro Qubit se utiliza para establecer primero una curva estándar y, a continuación, medir el valor de absorbancia para calcular la concentración de ADN. Ambos métodos pueden realizar la medición de la concentración de trazas de ADN, pero cada uno tiene sus ventajas y desventajas: el lector de microplacas aplica OD260 para calcular la concentración de ADN, pero su método de cálculo también es una estimación. Si la muestra está mezclada con un gran número de nucleótidos o proteínas y otras sustancias que puedan absorber luz ultravioleta, el error fotométrico será mayor, por lo que debemos intentar eliminarlas previamente.
Los lectores de microplacas y los espectrofotómetros UV utilizan absorbancia UV para la detección, que no puede distinguir entre ADN, ARN, ácidos nucleicos degradados, nucleótidos libres y otras impurezas, y la absorbancia también se ve muy afectada por la contaminación de otras sustancias, lo que hace que sus lecturas sean relativamente poco confiables. Al aumentar las muestras, que generalmente se miden en gotas, las muestras se enriquecen directamente sin dilución ni procesamiento, lo que permite la medición simultánea de múltiples muestras y el cálculo directo de la pureza del ADN a partir de las mediciones de OD260 / OD280. El fluorómetro Qubit, por otro lado, está diseñado para medir solo la concentración de ADN bicatenario mediante la aplicación de dos soluciones estándar de concentración conocida para establecer una curva estándar y la aplicación de las características de los tintes fluorescentes que se unen específicamente al ADN bicatenario. Sin embargo, cada muestra debe ser tratada previamente y luego medida individualmente, lo cual es engorroso para las aplicaciones de muestras por lotes, y la pureza del ADN extraído no se puede medir. En la aplicación específica de los dos se pueden seleccionar de acuerdo con sus propias necesidades para las pruebas de calidad del ADN 12,13,14.
La concentración de ADN de las muestras frescas fue mayor que la de las muestras viejas colocadas en alcohol y mayor que la de las muestras viejas no tratadas, independientemente de si la concentración de ADN se midió con un lector de microplacas o un fluorómetro Qubit. Para el almacenamiento a largo plazo, las muestras pueden sumergirse en alcohol para evitar el crecimiento de bacterias y hongos15,16.
Los diferentes métodos de medición tuvieron menos impacto en las mediciones de ADN de muestras antiguas sin ningún tratamiento, probablemente porque las muestras antiguas estaban más degradadas, especialmente las proteínas y el ARN pueden degradarse más rápido que el ADN. Por el contrario, las muestras frescas tenían más proteínas y ARN y, por lo tanto, tuvieron un mayor impacto en los resultados. Si solo se comparan las concentraciones de ADN bicatenario, deberíamos usar los resultados del fluorómetro Qubit, y los resultados de nuestros experimentos también crearon un gradiente significativo de concentración de ADN en las muestras antiguas y nuevas.
El contenido de ADN de las muestras frescas y viejas después de la extracción de ADN se puede utilizar para el análisis posterior de biología molecular. Al igual que en este experimento, los cebadores seleccionados para el gen del CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondrial tenían solo 278 pb, y todos ellos pudieron ser amplificados con éxito por el ADN. El gen del CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondrial es, a su vez, un locus reconocido en las moscas por su potencial de código de barras de ADN, lo que permite la identificación de especies de moscas necrófilas mediante análisis de secuenciación posterior17. La biología molecular de muestras conservadas más largas se puede lograr con éxito seleccionando cebadores para otras secuencias de ADN más cortas. Cabe destacar que las bandas electroforéticas de las muestras antiguas tenían dos bandas con diferentes posiciones y secuencias más cortas, probablemente debido a la amplificación inespecífica de los cebadores causada por la degradación del ADN junto con la baja temperatura de recocido.
Sin embargo, en este experimento, se conservaron menos muestras durante un largo período para satisfacer la necesidad de experimentos repetitivos, mientras que los resultados solo requerían muestras representativas. Por lo tanto, no realizamos una prueba de repetibilidad, que puede ser exploratoria para la preservación de muestras antiguas y nuevas, pero no afecta la extracción exitosa de muestras de mosca necrófila.
En resumen, el uso de un kit de extracción de ADN sanguíneo también puede ayudar en la extracción de ADN de mosca necrófila. Tanto las muestras viejas como las nuevas se pueden extraer con éxito, y todo el ADN extraído se puede utilizar para análisis posteriores. El alcohol también es favorable para la conservación a largo plazo de las muestras de ADN de mosca.

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An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

La inferencia de la hora de la muerte siempre ha sido una de las cuestiones clave y difíciles de resolver en la práctica judicial. En la práctica de la ciencia forense, para un caso criminal, la determinación del intervalo postmortem juega un papel crucial en la deducción del momento del crimen, encerrando al sospechoso y reduciendo el alcance de la investigación. Los métodos tradicionales para inferir la hora de la muerte se basan principalmente en fenómenos postmortem tempranos, que generalmente solo se pueden usar para inferir la hora de la muerte dentro de las 24 horas. Sin embargo, la longevidad de la muerte no puede determinarse por fenómenos post mortem. En la actualidad, se reconoce generalmente en la comunidad de la ciencia forense que la entomología forense tiene el potencial de ser un método eficaz para inferir un tiempo más prolongado de la muerte.
Los insectos necrófagos reciben su nombre por sus larvas que se alimentan de cadáveres. Entre ellas, siempre que haya un cadáver, las moscas necrófilas adultas serán las primeras en llegar al cadáver y poner sus huevos o larvas. Las larvas se alimentan de tejido cadavérico y maduran hasta convertirse en pupas, que se convierten en adultos. Las moscas necrófilas juegan un papel muy importante en la práctica de la ciencia forense debido a su ciclo de vida regular y distribución geográfica, por ejemplo, deduciendo la hora de la muerte y determinando el lugar de la muerte 1,2. Sin embargo, la barrera para el uso de moscas necrófilas en la práctica forense es la identificación de especies. Los métodos morfológicos todavía se utilizan como el método autorizado para la identificación de especies de moscas necrófilas. Sin embargo, la identificación morfológica de las especies requiere un alto grado de integridad de los insectos. Si las moscas estaban en diferentes etapas de desarrollo, o debido a cambios morfológicos causados por elecciones ambientales, todo eso dificulta el examen morfológico. En particular, la morfología de las pupas y conchas de pupa, que se encuentran con mayor frecuencia en la escena del crimen, es apenas reconocible. Esto, junto con la escasez de expertos morfológicos, dificulta enormemente la identificación morfológica de las especies. Por lo tanto, ha surgido la aplicación de métodos de biología molecular para la identificación de especies de moscas, lo que reduce la dificultad de la identificación morfológica y es independiente de la etapa de desarrollo 3,4,5,6,7.
El primer paso en la identificación de especies de moscas necrófilas basadas en métodos de biología molecular es la extracción eficiente de ADN, mientras que actualmente no se dispone de kits especializados para la extracción de ADN de insectos. Y cómo usar kits de sangre comunes para la extracción de ADN de moscas necrófilas se vuelve más relevante desde el punto de vista forense. Las moscas necrófilas que se encuentran en las escenas del crimen a menudo están mutiladas o han sufrido descomposición y degradación del ADN. Las muestras de mosca no están disponibles inmediatamente para la extracción de ADN después de la adquisición, o si es posible, es necesario conservar muestras completas debido a los requisitos de preservación de la evidencia. Sobre la base de los requisitos anteriores, en este estudio, aplicamos el kit de ADN sanguíneo basado en la digestión de proteinasa K, y seleccionamos tres muestras frescas de Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (Figura 1), una muestra vieja de C. megacephala colocada en alcohol durante dos años, y una muestra de C. megacephala colocada en almacenamiento protegido a la luz durante dos años, pesamos cada una de las cinco muestras, eligió el tejido del tórax del insecto para la extracción de ADN. Comparando la calidad y pureza del ADN extraído de las muestras antiguas y nuevas, se realizó la amplificación por PCR y la electroforesis del ADN extraído con cebadores necrófilos específicos de mosca ubicados en la secuencia del gen de CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondrial.

<table><tbody><tr><td>Tampón AE</td><td>Qiagen</td><td>172026832</td><td>tampón de elución de ADN</td></tr><tr><td>Tampón AL</td><td>Qiagen</td><td>tampón de lisis</td><td>172028374</td></tr><tr><td>Tampón ATL</td><td>Qiagen</td><td>tampón de lisis tisular</td><td>172028162</td></tr><tr><td>tampón AW1</td><td>Qiagen</td><td>tampón de eliminación de proteínas</td><td>172028760</td></tr><tr><td>tampón AW2</td><td>Qiagen</td><td>57203108</td><td>tampón</td></tr> <tr><td>de desalinizaciónC1-J-2495</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109216</td><td>forword cebador</td></tr><tr><td>C1-N-2800</td><td>Taihe Biotechnology</td><td></td><td>TW21109217 cebador inverso</td></tr><tr><td>D2000 escalera</td><td>de ADN en tiempos reales (Pekín) Biotecnología</td><td>RTM415</td><td>Medir la posición de las bandas electroforéticas</td></tr><tr><td>Columna de centrifugación DNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>166050343</td><td>columna de adsorción de ADN</td></tr><tr><td>Incubadora de baño seco</td><td>Miulab</td><td>DKT200-2D</td><td>utilizado para calentar</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini mezclador</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>acción oscilatoria</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Qiagen</td><td>172026218</td><td>Inactivación de nucleasas intracelulares y otras proteínas</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Microcentrífuga de 2321611188 <td></td></tr><tr><td>velocidad</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td>centrífuga</td></tr><tr><td>Standard#1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Standard#2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Generador de imágenes en gel</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>Mezcla de gel</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>Mezcla de PCR</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>Mezcla de</td></tr> <tr><td>PCRTermociclador</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td> solución de trabajo <td>de PCR ordinaria</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción de adn y comparación entre muestras de moscas necrófilas viejas y frescas

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Se seleccionaron un total de cinco muestras de Chrysomya megacephala (tres muestras frescas, una muestra almacenada en alcohol durante 2 años y una muestra almacenada en sellado seco durante 2 años protegida únicamente de la luz) para investigar si un kit de extracción de ADN sanguíneo podía extraer ADN de moscas necrófilas y determinar si el alcohol podía prolongar la conservación del ADN de las moscas necrófilas. En primer lugar, se utilizó el kit de extracción de ADN sanguíneo para extraer ADN de los tejidos del tórax. A continuación, se examinaron la pureza y la concentración del ADN utilizando un lector de microplacas y un fluorómetro. Finalmente, la amplificación por PCR y la electroforesis del ADN extraído se realizaron con cebadores necrófilos específicos de mosca localizados en la secuencia del gen CO I mitocondrial. Los resultados mostraron que la pureza del ADN de todas las muestras fue superior a 2,0. Se observó que la concentración de ADN era del siguiente orden: muestras frescas > muestras viejas conservadas con alcohol > muestras viejas sin tratar. Todas las muestras tenían bandas electroforéticas específicas después de la amplificación por PCR. En conclusión, se puede utilizar un kit de extracción de ADN sanguíneo para extraer ADN de moscas necrófilas con éxito, y la concentración de ADN de las muestras frescas de moscas es mayor que la de las muestras de moscas viejas. Las moscas se pueden almacenar en alcohol durante mucho tiempo.

Utilizamos un lector de microplacas para medir los valores de OD260 y OD280 de la solución de ADN extraída y luego obtuvimos los valores de OD260/OD280 para evaluar la pureza del ADN. El OD260/OD280 de todas las muestras frescas y la muestra antigua 1 fue mayor que 2. El OD260/OD280 de la antigua muestra 2 tuvo un valor máximo de 2,187 aunque el promedio fue de 1,753, y sus tres mediciones fluctuaron mucho debido a los pequeños valores (≤0,01) tanto de su OD280 como de su OD280 (Tabla 1). A partir del valor de OD260 obtenido, estimamos la concentración de ADN. La concentración de ADN de las tres fue del orden: muestras frescas &gt; muestra antigua 1 &gt; muestra antigua 2, medidas con el lector de microplacas, pero la diferencia entre las muestras frescas y las muestras antiguas fue pequeña, solo ~ 10-20 ng/μL (Tabla 1), mientras que la concentración de ADN de las tres muestras frescas medidas por fluorómetro Qubit fue mayor que la medida por el lector de microplacas en 125-130 ng/μL, con una diferencia de 15 ng/μL en la muestra antigua 1 y solo 1,3 ng/μL en la muestra antigua 2. La concentración de ADN de las muestras frescas &gt; muestra antigua 1 &gt; muestra antigua 2 (Tabla 2).
El ADN extraído por el método de extracción utilizado actualmente contiene todos los componentes de ADN de diferentes fuentes en la muestra. Eso significa que la solución de ADN no era solo una solución de ADN genómico de mosca. Los cebadores para amplificar específicamente los fragmentos del gen del CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondrial de la mosca se seleccionaron consultando la bibliografía y se verificaron mediante NCBI-Blast Primer. Los resultados mostraron que el cebador directo C1-J-2495 y el cebador inverso C1-N-2800 del gen del CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondrial eran cebadores específicos de mosca con polimorfismo de secuencia y cubrían muchas especies de moscas. Los resultados de la amplificación no mostraron genes humanos. Se trata de un par de biomarcadores de ADN fiables para la identificación de moscas necrófilas y se seleccionaron para la verificación de los resultados de este experimento.
Todas las diferentes muestras mostraron bandas electroforéticas evidentes con longitudes que oscilaban entre 250 pb y 400 pb. Las bandas fueron más brillantes en las muestras frescas que en las muestras antiguas, y las muestras viejas colocadas con alcohol (Figura 2, Old1) fueron más brillantes que las muestras antiguas no tratadas (Figura 2, Old2), pero las muestras antiguas también tenían dos bandas en diferentes posiciones. El control en blanco no tenía bandas (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig01.jpg"> Figura 1: Imágenes de Chrysomya megacephala desde diferentes ángulos. (A) Hombre; (B) mujer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig02.jpg"> Figura 2: Electroferograma de productos de amplificación por PCR. Las tres primeras bandas de la izquierda son productos de amplificación por PCR de ADN de muestras frescas de mosca. La cuarta banda electroforética es el producto de PCR del ADN de la antigua muestra de mosca conservada en alcohol. La quinta banda es el producto de PCR del ADN de la muestra de mosca antigua sin ninguna conservación especial. La sexta banda es un control en blanco; es limpio, lo que demuestra que no se produjo contaminación durante la amplificación por PCR. En el extremo derecho está la escalera de ADN, donde etiquetamos las posiciones de ADN con longitudes de 250 pb y 400 pb. Todas las bandas electroforéticas de los productos de PCR de las muestras estaban ligeramente por encima de las bandas de escalera de 250 pb y por debajo de 400 pb. Esta posición coincide con la longitud del gen diana de 278 pb. Es más obvio a simple vista que las bandas de ADN que representan las muestras frescas son más brillantes que las de las muestras antiguas. Las muestras antiguas comprenden otras bandas de ADN que están presentes allí en genes menos intensos, no diana, de diferentes longitudes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muestra</td>
			<td>Fresco1</td>
			<td>Fresco2</td>
			<td>Fresco3</td>
			<td>Antiguo1</td>
			<td>Antiguo2</td>
		</tr><tr><td>OD260/OD280</td>
			<td>2.354±0,036</td>
			<td>2.245±0,027</td>
			<td>2.060±0.038</td>
			<td>2.143±0.012</td>
			<td>1.753±0,421</td>
		</tr><tr><td>ADN (ng/μL)</td>
			<td>119,91±1.686</td>
			<td>116.084±4.965</td>
			<td>95.239±3.401</td>
			<td>86.845±6,14</td>
			<td>10.151±0.168</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Medición de la pureza y concentración del ADN con un lector de microplacas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muestra</td>
			<td>Fresco1</td>
			<td>Fresco2</td>
			<td>Fresco3</td>
			<td>Antiguo1</td>
			<td>Antiguo2</td>
		</tr><tr><td>ADN (ng/μL)</td>
			<td>243.333±1.528</td>
			<td>237.667±2.082</td>
			<td>226.000±2.000</td>
			<td>101.000±0.000</td>
			<td>11.433±0,058</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Medición de la concentración de ADN con un fluorómetro.

Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de mosca necrófila fresca y vieja utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.

Extracción de ADN y comparación entre muestras de moscas necrófilas viejas y frescas

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