Name: Evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Aprende a evaluar la recuperación funcional del diafragma en ratas tras hemisección espinal C2 mediante EMG. Este método revela el papel de la señalización BDNF en la neuroplasticidad respiratoria.

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Los autores reconocen la fuente de financiación de los NIH (NIH R01HL146114).

Evaluación estandarizada de DIAm EMG post-C2SH en ratas para minimizar la variabilidad

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Hemisección espinal C2 El procedimiento descrito en este artículo hace hincapié en las evaluaciones de la actividad de DIAm EMG que sirven como validación de una lesión espinal C2 que atraviesa los funículos lateral y ventral sin afectar los funículos dorsales (Figura 2A). El abordaje quirúrgico propuesto tiene dos beneficios principales. En primer lugar, preserva los funículos dorsales, que preservan la función ambulatoria en las ratas, al tiempo que corta las entradas ipsilaterales a las neuronas motoras frénicas. En segundo lugar, mediante la monitorización de DIAm EMG, podemos validar la eficacia de la lesión C2 en la eliminación de la actividad eupneica de iDIAm EMG inicialmente durante la cirugía mientras los animales están anestesiados. En el día 3 después de la lesión, mientras los animales están anestesiados, verificamos que efectivamente hay un silenciamiento continuo de la actividad eupneica de iDIAm EMG. Previamente se demostró que las entradas excitadoras de rVRG en las neuronas motoras frénicas y la expresión del receptor NMDA en las neuronas motoras frénicas se reducen a los 3 a 7 días después de la lesión y que tanto la entrada sináptica glutamatérgica como la expresión del receptor NMDA aumentan con el tiempo después de 7 días después de la lesión33,42. Estos datos, combinados con la confirmación histológica de la lesiónC2 10,13,29,30,33, sugieren que la inactividad continuada bajo anestesia en el día 3 después de la lesión proporciona información sobre la eficacia de la C2SH inicial. En estudios realizados en varios años, se observaron tasas relativamente estables de recuperación espontánea bajo anestesia entre el 30% y el 40% a los 14 días después de la C 2 SH 18,19,20,29,31,43, lo que sugiere que este método de verificación del éxito del C2SH es reproducible y confiable.
El procedimiento C2SH implica varios pasos críticos. Es importante destacar que el modelo C2SH propuesto aquí preserva los funículos dorsales y, por lo tanto, no conduce a déficits motores en las extremidades. En los modelos de hemisección espinal completaC2 que involucran los funículos dorsales, los déficits motores de las extremidades son considerablemente mayores 3,4,5,6,7,37. Por lo tanto, un beneficio adicional del modelo C2SH (Figura 2A) es que, además del silenciamiento de la actividad EMG eupneica iDIAm en ratas C2 lesionadas anestesiadas, las ratas son funcionalmente similares a las ratas de laminectomía simulada en términos de deambulación y otras funciones. En consecuencia, generalmente son capaces de alimentarse y acicalarse por sí mismos, lo que reduce la carga de cuidados y al mismo tiempo permite estudios del control neuromotor DIAm y la neuroplasticidad respiratoria. Para garantizar que el modeloC2 se implemente adecuadamente, se debe tener mucho cuidado para evitar lesiones excesivas. Insertar el cuchillo de disección justo debajo de donde la raíz dorsal ingresa a la médula espinal y cortar la porción ventral con moderación son reglas generales útiles. El objetivo es garantizar el cese de la actividad de EMG eupneico iDIAm; Esto se puede hacer con múltiples cortes pequeños si es necesario. De hecho, en la semana siguiente al C2SH, quedará claro si hubo un daño excesivo en la médula espinal si los animales tienen dificultades para deambular y alcanzar los gránulos de comida.
Colocación de electrodos y registros de EMG Los electrodos EMG DIAm crónicos tienen varios beneficios claros sobre otros enfoques. Los electrodos pueden (y deben) implantarse varios días antes del procedimiento deC2SH, permitiendo suficiente tiempo para la recuperación y sin necesidad de una laparotomía y unaC2SH durante la misma sesión quirúrgica. Esto es importante porque está bien aceptado que la laparotomía provoca la inhibición de la DIAm 35,36. Al implantar electrodos DIAm crónicos, tampoco hay necesidad de laparotomías repetidas, que se realizaron en trabajos anteriores10,13; también existe un menor riesgo de neumotórax, ya que no se insertan electrodos en el DIAm durante cada sesión. Sin embargo, pueden ocurrir varios eventos adversos potencialmente graves como resultado de la colocación de electrodos. Aunque el riesgo de neumotórax se reduce al evitar las inserciones repetidas de electrodos, no se anula por completo y, de hecho, puede producirse un neumotórax, causando la muerte inmediata o problemas prolongados. Con el fin de reducir este riesgo, es una buena práctica asegurarse de que la aguja que se está enhebrando a través del DIAm no perfore la superficie superior del DIAm. Además, evite el uso de pinzas afiladas que puedan infligir daño al DIAm mientras manipula los alambres de los electrodos. De vez en cuando, las ratas pueden masticar los puntos de sutura en su abdomen, potencialmente destripándose si se les deja a su suerte. Las ratas deben ser observadas a intervalos regulares después de la colocación del electrodo para detectar este tipo de comportamientos a tiempo. En algunos casos, puede ser posible anestesiar a las ratas para reparar el daño de los puntos. Sin embargo, es mejor si este comportamiento se mitiga proporcionando un alivio adecuado del dolor durante y después de la cirugía y asegurándose de que el campo estéril no se rompa durante la cirugía. En casos extremos, puede ser necesario aplicar la eutanasia a las ratas que se quitan repetidamente los puntos de sutura.
El registro y análisis de las señales EMG no es el objetivo principal del presente estudio y depende en gran medida del equipo y el software particulares disponibles en cada laboratorio. Aunque la información sobre el equipo se proporciona en la Tabla de Materiales, existe una amplia variedad de opciones de hardware para amplificar y registrar la actividad de EMG, y los detalles dependerán de una combinación de características, disponibilidad y asequibilidad para cada laboratorio. Sin embargo, hay algunos principios generales de registro de EMG que es importante mencionar. Un problema potencial es el movimiento o la destrucción de los electrodos implantados, lo que puede limitar las evaluaciones cuantitativas de DIAm EMG. Si los electrodos se han desprendido del DIAm, o si las ratas han logrado consumir o dañar los cables externalizados, es posible que no sea posible registrar la actividad de EMG o que el nivel de ruido cambie. Esto se puede evitar confirmando que los electrodos están firmemente asegurados en el DIAm, y se puede registrar una señal con una alta relación señal-ruido (SNR) durante la cirugía de colocación del electrodo DIAm. Además, la externalización de los cables de los electrodos en la parte alta del dorso y el corte del exceso de alambre de modo que las ratas no puedan acceder a los cables de los electrodos son factores que conducen al éxito de los electrodos crónicos. Como alternativa a los cables externalizados, las tapas de cabeza37 o la telemetría44,45 pueden ser opciones razonables. Ambos enfoques pueden obtener registros en animales despiertos más fácilmente, pero pueden ser un poco más difíciles de implementar que simplemente externalizar los cables multifilamento. Todas las fuentes electrónicas cercanas pueden ser potencialmente fuentes de ruido. Es primordial que todo el equipo esté conectado a tierra adecuadamente, que se utilicen cables blindados y que no se toquen las ratas mientras se realizan las grabaciones activas. Además de apagar las almohadillas térmicas electrónicas durante la grabación, es posible que sea necesario apagar temporalmente las luces, los equipos cercanos, las mesas quirúrgicas eléctricas y otros dispositivos similares para lograr grabaciones de bajo ruido. Para minimizar las influencias ambientales, los equipos electrónicos que no necesitan estar encendidos para las grabaciones DIAm EMG deben apagarse. Cuando sea posible, las grabaciones deben realizarse en una habitación con protección eléctrica. Con el tiempo, la cicatrización del tejido y la fibrosis alrededor de los electrodos DIAm EMG pueden disminuir la conductividad del electrodo, reduciendo la SNR. Además, incluso ligeros cambios en la postura pueden tener un gran impacto en la señal DIAm EMG; por lo tanto, para minimizar estos problemas potencialmente complicados, DIAm EMG debe grabarse con las ratas en la misma postura durante las sesiones de grabación.
Otra consideración importante es la configuración de filtrado y muestreo. El tipo de electrodo (es decir, intramuscular vs. esofágico/de superficie) es extremadamente relevante cuando se trata de determinar el contenido de frecuencia de una señal y, en consecuencia, los filtros de paso alto y bajo apropiados para ella. Se ha realizado un esfuerzo considerable para determinar los filtros óptimos para DIAm EMG46 de superficie/esófago. No se han realizado estudios similares en el DIAm de rata, pero previamente demostramos que, efectivamente, la totalidad del contenido de frecuencia del DIAm EMG registrado utilizando electrodos intramusculares crónicos en ratas estaba por debajo de 1000 Hz, con la frecuencia del centroide alrededor de 300 Hz47. En una comparación directa de las frecuencias medias y medianas del espectro de potencia de la EMG del bíceps braquial en humanos obtenida a través de electrodos de superficie e intramusculares, Christensen et al.48 encontraron que tanto la frecuencia media como la mediana eran aproximadamente 3 veces mayores para los electrodos intramusculares en comparación con los electrodos de superficie. En el DIAm, los investigadores han reportado frecuencias centroides de alrededor de 100 Hz cuando se utilizan electrodos esofágicos bipolares 49,50,51,52,53,54, lo que sugeriría que los 300 Hz, que se determinaron previamente para los electrodos intramusculares, coinciden aproximadamente con la misma tendencia mostrada por Christensen et al.48. A pesar de esto, múltiples estudios publicados que utilizan DIAm EMG intramuscular en modelos de roedores han colocado sus filtros de paso alto a 300 Hz 4,37,55,56 y algunos incluso han llegado hasta 500 Hz57. Es indiscutible que este enfoque de filtrado reduciría sustancialmente la amplitud de la señal EMG DIAm al menos a la mitad. Proponemos un enfoque mucho menos destructivo: (1) filtrado de paso alto a 100 Hz porque la mayor parte del espectro de potencia del ECG está por debajo de 100 Hz, mientras que comparativamente poco del espectro de potencia del DIAm EMG está por debajo de 100 Hz51,52, y (2) posteriormente eliminando el ECG sobrante mediante la coincidencia de formas de onda58. Por lo tanto, los filtros apropiados para DIAm EMG para la mayoría de los estudios pueden establecerse entre 100 Hz y 1000 Hz, con una frecuencia de muestreo de al menos 2000 Hz para capturar todas las características relevantes dentro de los datos. A continuación, se pueden realizar análisis detallados de la EMG DIAm utilizando las técnicas publicadas en informes anteriores 40,41,47,58.
Animales despiertos y anestesiados En particular, algunos estudios han destacado que los modelos C2SH de cSCI no conducen a la inactividad completa de eupneic iDIAm EMG23,37. En cierto sentido, esto no es sorprendente, ya que se ha observado previamente que la actividad de "avance" ocurre durante comportamientos que requieren un impulso más alto (por ejemplo, respiraciones profundas y la respuesta a la oclusión de las vías respiratorias)4,7,29,42. Estos datos sugieren que probablemente no sea apropiado pensar en el modeloC2SH como un verdadero modelo de inactividad continua. De hecho, parece que el impulso es lo suficientemente alto en los animales despiertos como para que la actividad EMG eupneica iDIAm esté presente tan pronto como cuatro días después de un C2SH37 completo, aunque no está presente de manera consistente un día después de la lesión23. En todos los casos, la anestesia suprime la actividad de iDIAm después de la hemisección espinal cervical superior, como se destacó en informes previos23,38 y se mostró en la Figura 4 y la Figura 5. No hay datos publicados disponibles sobre la actividad de DIAm EMG en ratas despiertas con el C2SH con funículos dorsales preservados propuesto en el presente manuscrito (Figura 2A). El trabajo futuro debería proporcionar una caracterización detallada del curso temporal de la actividad de DIAm EMG en animales despiertos con este modelo C2SH. Dicho esto, sigue siendo prudente realizar la validación de la ausencia continua de inactividad eupneica de iDIAm en el día 3 después de la lesión bajo anestesia para imitar las condiciones experimentales durante las cuales la médula espinal se lesionó/seccionó inicialmente. Cuando puede haber actividad eupneica de iDIAm EMG en animales despiertos en el día 3 después de la lesión, se observa que incluso medias dosis de anestésicos generalmente conducirán a un cese completo de la actividad de eupneic iDIAm EMG. Con estas dosis, los animales están tranquilos y sedados. Además de verificar el silenciamiento de la actividad EMG eupneica de iDIAm durante elC2SH y en el día 3 post-lesión, se recomienda la extracción de la médula espinal después del experimento terminal para realizar la confirmación histológica del sitio y la extensión delC2SH 9,29,59. La confirmación histológica de la lesión, cuando se combina con la confirmación funcional de la actividad EMG eupneica iDIAm silenciada, proporciona una fuerte evidencia de un éxito deC2SH.
El presente artículo presenta un C2SH de cSCI en ratas que conduce al silenciamiento inmediato de la actividad EMG eupneica iDIAm con silenciamiento continuo bajo anestesia en el día 3 después de la lesión. Debido a la preservación del funículo dorsal en el modelo C2SH propuesto en el presente manuscrito, se preserva la función motora de las extremidades, evitando así efectos fuera del objetivo. Esto permite realizar estudios longitudinales de los efectos de una lesión cervical alta en el control neuromotor DIAm en ratas que, por lo demás, están relativamente sanas, lo que añade una carga mínima de cuidados para los investigadores. La validación de la inactividad bajo anestesia en el día 3 después de la lesión garantiza que se establezca una línea de base clara para evaluar el grado posterior de recuperación de la EMG iDIAm eupneica. Este enfoque proporciona un método riguroso, fiable y reproducible para realizar un C2SH en ratas. Este modelo tiene el potencial de mejorar en gran medida la comprensión del curso temporal de la neuroplasticidad respiratoria y su intersección con posibles estrategias terapéuticas.

Hay más de 300,000 personas con lesión de la médula espinal (SCI) en los Estados Unidos, aproximadamente la mitad de las cualestienen lesiones cervicales. Estas lesiones resultan en una pérdida significativa de bienestar y ejercen una presión financiera sobre las personas, sus familias y el sistema de atención médica. Afortunadamente, la mayoría de las lesiones de la médula espinal sonincompletas, lo que ofrece la posibilidad de fortalecer las vías preservadas. Esta neuroplasticidad puede permitir la recuperación de al menos algunas funciones, incluida la actividad DIAm, que es importante para los comportamientos ventilatorios y no ventilatorios. Por lo tanto, la promoción de la neuroplasticidad es una vía prometedora de investigación para ayudar a las personas con LME2.
Los modelos de LME en roedores tienen el potencial de contribuir sustancialmente al descubrimiento de tratamientos para mejorar la salud humana. Uno de los modelos clásicos de LM utilizados para estudiar la neuroplasticidad es la transección unilateral (hemisección) de la médula espinal enC2 (C2SH), que deja intacto el lado contralateral 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. El efecto deC2SH sobre la producción frénica y la importancia de las vías contralaterales preservadas fue revelado por primera vez hace más de cien años por Porter12, cuyo artículo seminal sentó las bases para los estudios modernos de la neuroplasticidad respiratoria. El modeloC2SH interrumpe las entradas descendentes del grupo respiratorio ventral rostral (rVRG) en la médula, que contiene las neuronas premotoras responsables de transmitir la salida de la generación del ritmo respiratorio14. Estas neuronas premotoras rVRG también transmiten el impulso neuronal excitatorio a las neuronas motoras frénicas (Figura 1). Varios investigadores han adoptado diferentes enfoques para el modelo C2SH 10,11,15,16, lo que puede explicar en parte parte la variabilidad en la recuperación entre los estudios. Brevemente, los abordajes varían en términos de preservar los funículos dorsales, realizar una hemisección completa o realizar una transección parcial lateral que no interrumpa completamente las entradas descendentes de la rVRG ipsilateral. En general, los modelos de C2SH son particularmente útiles para estudiar la neuroplasticidad respiratoria debido a las tasas de recuperación espontánea de la actividad electromiográfica (EMG) eupneica iDIAm a lo largo del tiempo, que puede mejorarse mediante varios factores, incluida la señalización neurotrófica 17,18,19,20,21. Sin embargo, primero se debe establecer una pérdida inicial de la función, definida como el silenciamiento de la actividad EMG eupneica de iDIAm, antes de que la recuperación pueda clasificarse claramente. Esta validación de la inactividad en el momento de la C2SH no se realiza en varios estudios 3,4,6,7,11,22,23.
Las evaluaciones histológicas de la médula espinal extirpada solo proporcionan evidencia de daño en la ubicación apropiada de las vías bulboespinales excitadoras ipsilaterales que inervan las neuronas motoras frénicas en la médula espinal, pero la histología no sustituye la evidencia fisiológica (p. ej., DIAm EMG). Además, las evaluaciones histológicas se realizan ex vivo en puntosterminales (a menudo varias semanas o meses después de la lesión) y no proporcionan información "en tiempo real". Algunos investigadores han observado que la magnitud de la lesión se relaciona con la cantidad de déficit funcional o falta del mismo 5,24,25,26. Es importante tener en cuenta que la validez de tales afirmaciones probablemente depende en gran medida de cómo se clasifique la "función" (es decir, cuáles son las tareas funcionales y cómo se cuantifican), y la variabilidad entre los estudios pone de manifiesto la dificultad de producir lesiones funcionalmente idénticas en todos los animales. De hecho, los investigadores han enfatizado que la relación entre el grado de lesión y la función locomotora de los músculos de las extremidades (cuantificada por la puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB)24) no es lineal27,28. En estudios previos, no hemos encontrado relación entre la extensión de la C2SH y el grado de recuperación de la actividad EMG eupneica iDIAm después de la lesión 10,29,30,31, aunque otros investigadores han reportado una relación entre la función ventilatoria y el grado de preservación de la sustancia blanca 5. Por lo tanto, en el caso del modelo C2SH, es beneficioso y necesario un enfoque para la validación funcional de la inactividad de iDIAm en el momento de la cirugía y, preferiblemente, en el curso temprano del curso del tiempo de los experimentos de lesión crónica de la médula espinal.
El presente artículo destaca el uso de DIAm EMG para la confirmación en tiempo real de la pérdida inicial de DIAm EMG durante la respiración después de la C2SH, así como las evaluaciones confirmatorias posteriores a los 3 días (Día 3) después de la lesión 18,21,31,32,33. En trabajos anteriores con el modelo C2SH, se realizaron laparotomías repetidas para registrar DIAm EMG 10,13,30,34. Sin embargo, trabajos más recientes han utilizado electrodos de EMG crónicos, que permiten el registro de EMG en ratas anestesiadas y despiertas. Además, los electrodos crónicos reducen el riesgo de neumotórax y no requieren laparotomías repetidas, lo que puede causar inhibición del DIAm35,36. A pesar de que las versiones del modelo C2SH han sido utilizadas por muchos investigadores, la confirmación del silenciamiento de la actividad de iDIAm no se realizó en el momento de la cirugía 3,4,6,7,11,22,23. Sin tal confirmación de la inactividad, es difícil saber qué parte de la recuperación posterior atribuir a la neuroplasticidad de las vías ipsilaterales frente a las contralaterales, que pueden tener impactos diferenciales. Esta es una consideración importante porque el impulso neuronal inspiratorio de la rVRG a las motoneuronas frénicas es principalmente ipsilateral, con una pérdida de aproximadamente el 50% de las entradas glutamatérgicas excitatorias a las neuronas motoras frénicas después de C2SH33. Sin embargo, quedan entradas excitadoras inspiratorias de la rVRG contralateral que decusan por debajo del sitio de la lesión para inervar las neuronas motoras frénicas ipsilaterales y pueden fortalecerse a través de la neuroplasticidad para promover la recuperación funcional. Al eliminar la entrada excitatoria ipsilateral predominante a las neuronas motoras frénicas, se pierde la actividad EMG eupneica iDIAm (al menos bajo anestesia), mientras que la actividad del cDIAm continúa e incluso se incrementa. La pérdida de la actividad EMG de iDIAm durante la respiración es, por lo tanto, una medida de un C2SH exitoso (Figura 2).
Algún nivel de actividad de iDIAm EMG está presente tan pronto como 1-4 días después de C2SH en animales despiertos23,37. Además, en animales descerebrados, la actividad de iDIAm está presente minutos u horas después de la hemisección cervical superior y es suprimida por la anestesia38. Además, el éxito del C2SH se valida al confirmar la ausencia de actividad de iDIAm EMG durante la respiración (eupnea) en ratas anestesiadas el día 3 después de la lesión. Los estudios de imagen confocal confirmaron la pérdida de entradas sinápticas glutamatérgicas en las neuronas motoras frénicas durante esta etapa inicial de la lesión37. En el día 3 después de la lesión, si hay alguna actividad eupneica residual de iDIAm EMG, esto se interpreta como evidencia de eliminación incompleta del impulso inspiratorio descendente ipsilateral de la rVRG. El presente artículo se divide en tres secciones: (1) registros crónicos de EMG DIAm, (2) C2SH y (3) adquisición de datos de EMG en animales despiertos y anestesiados. Este protocolo describe un modelo deC2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

<table><tbody><tr><td>Aguja de 25 G</td><td>Cardinal Health</td><td>1188825100</td><td>Covidien Monoject Hypdermic Agujas estándar: 25 g x 1" (0,508 mm x 2,5 cm) A</td></tr><tr><td>3-0 Vicryl Violet Trenzado</td><td>Ethicon</td><td>J774D</td><td>3-0 Sutura</td></tr><tr><td>Adson-Brown Pinzas</td><td>de ciencia fina Fine Science Tools</td><td>11627-12 Forma de</td><td>la punta: recta, puntas: dientes de tiburón, ancho de la punta: 1,4 mm, dimensiones de la punta: 2 x 1,4 m, aleación / material: acero inoxidable, longitud: Jaula</td></tr><tr><td>estilo Bowman</td> de 12 cm <td>Braintree Scientific</td><td>POR-530 Rango de</td><td>peso: 250 hasta 750 g; Longitud máxima: 9" (228 mm); La unidad básica está construida de acrílico enjoyado de .5" (123 mm).</td></tr><tr><td>Portaagujas Castroviejo</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td>Forma de la punta: recta, Ancho de la punta: 1,5 mm, Longitud de sujeción: 10 mm, Bloqueo: Sí, Tijeras: No, Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 14 cm, Dentado: Sí, Característica: Cable de clip de carburo de tungsteno</td></tr><tr><td>1m TP blindado</td><td>Biopac Systems, Inc</td><td>LEAD110S</td><td>Cables conductores blindados para EMG</td></tr><tr><td>Software de adquisición de datos</td><td>LabChart LabChart</td><td>7.3.8</td><td>Software de registro, visualización y análisis de datos para grabaciones multicanal y evaluaciones en tiempo real Software de</td></tr><tr><td>análisis de datos - Matlab 2023b</td><td>Mathworks, Inc.</td><td>Versión 23.2</td><td>Lenguaje de programación de propósito general para análisis post hoc</td></tr><tr><td>Cuchillo de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Filo: 4 mm, Grosor: 0,5 mm, Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 12,5 cm, Forma de la hoja: Angulado 30 grados;</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #3 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11293-00</td><td>Estilo: #3, Forma de la punta: recta, Puntas: Estándar, Dimensiones de la punta: 0,17 x 0,1 mm, Longitud: 12 cm, Aleación / Material: Amplificador de</td></tr><tr><td>electromiograma</td> Dumostar <td>Biopac Systems, Inc</td><td>EMG100C</td><td>Amplificador EMG</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14 Forma de</td><td>la punta: curvada, Tamaño de la copa: 2,5 mm, Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 13 cm, Acción conjunta: Aleación simple</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>/ Material: Acero inoxidable, Longitud: 14 cm, Acción conjunta: Individual, Tamaño de la copa: 1 mm, Forma de la punta:</td></tr><tr><td>Módulo de fuente de alimentación aislada</td> curvada <td>Biopac Systems, Inc</td><td>IPS100C</td><td>Opera módulos amplificadores de la serie 100 independientes de la serie MP de Biopac Systems, Inc. Sistema de adquisición de datos</td></tr><tr><td>Kelly Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13019-14</td><td>Puntas: dentadas, Ancho de la punta: 1,5 mm, Longitud de sujeción: 22 mm, Aleación / Material: acero inoxidable, Longitud: 14 cm, Forma de la punta:</td></tr><tr><td>Cureta de cuchillo</td> curvo <td>V. Mueller</td><td>VM101-4414</td><td>Punta: Afilada, Diámetro de la punta: 2 mm</td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección Biomedical</td><td>Research Instruments, Inc.</td><td>11-2420</td><td>Longitud: 4", Ángulo: Recto, Longitud de la hoja: 23 mm</td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable multifilamento</td><td>Cooner Wire, Inc.</td><td>COMO 631</td><td>AWG 40; Diámetro total: 0,011 mm (con aislamiento), 0,008 mm (sin aislamiento).</td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td>Sistema de adquisición</td></tr><tr><td>de datos Bisturí Hoja #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Forma de la hoja: Inclinada, Filo: 20 mm, Grosor: 0,4 mm, Aleación / Material: Acero al carbono</td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Aleación / Material: Acero inoxidable, Longitud: 12 cm</td></tr><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Inotiv</td><td>Código de pedido: 002</td><td>Ratas endogámicas Sprague Dawley (hembras y machos)</td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td>Microscopio quirúrgico&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de corte para suturas</td><td>George Tiemann & Co.</td><td>110-1250SB</td><td>Aleación / Material: Acero inoxidable, Forma de la punta: recta, Puntas: Afiladas/romas, Longitud: 4.5 "</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>Puntas: Afiladas, Filo cortante: 2,5 mm, Diámetro de la punta: 0,05 mm, Longitud: 8 cm, Aleación / Material: Acero inoxidable, Dentado: No, Forma de la punta: Recta</td></tr><tr><td>Weitlaner Retractor</td><td>Codman</td><td>50-5647</td><td>Puntas: 2 x 3 romas, Longitud: 4.5"</td></tr></tbody></table>

evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas

Assessing Functional Recovery of Eupneic Diaphragm Activity Following Unilateral Cervical Spinal Cord Hemisection in Rats

Después de la lesión de la médula espinal, la activación del DIAm puede verse afectada dependiendo de la extensión de la lesión. El presente manuscrito describe un modelo de hemisecciónC2 unilateral (C2SH) de SCI que interrumpe la actividad electromiográfica (EMG) del diafragma ipsilateral eupneico (iDIAm) durante la respiración en ratas. Para evaluar la recuperación del control motor DIAm, primero se debe establecer claramente el grado de déficit debido a C2SH. Al verificar una pérdida inicial completa de iDIAm EMG durante la respiración, la recuperación posterior se puede clasificar como ausente o presente, y el grado de recuperación se puede estimar utilizando la amplitud de EMG. Además, al medir la ausencia continuada de actividad EMG de iDIAm durante la respiración después del período de shock espinal agudo después deC2SH, se puede validar el éxito de la C2SH inicial. La medición de la actividad EMG del diafragma contralateral (cDIAm) puede proporcionar información sobre los efectos compensatorios de C2SH, que también refleja la neuroplasticidad. Además, los registros de DIAm EMG de animales despiertos pueden proporcionar información fisiológica vital sobre el control motor del DIAm después de C2SH. Este artículo describe un método para un modelo deC2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

El enfoque presentado en este artículo minimiza la variabilidad entre operadores mediante el establecimiento de criterios claros para evaluar DIAm EMG en un modelo de rata de C2SH. En primer lugar, se debe observar el cese de la actividad EMG eupneica de iDIAm inmediatamente después de C2SH, como se muestra en la Figura 2. De lo contrario, se puede realizar una transección secundaria hasta que desaparezca la actividad eupneica de iDIAm. En segundo lugar, en el día 3 después de la SHC2, se debe verificar la ausencia continuada de EMG iDIAm eupneico mientras los animales están anestesiados. La figura 4A muestra un ejemplo de un C2SH exitoso determinado por la ausencia continua de actividad EMG eupneica iDIAm bajo anestesia el día 3 después de la lesión. La Figura 4B muestra la actividad de DIAm EMG en el mismo animal en condiciones de vigilia no anestesiadas, lo que destaca la reducción, pero no la ausencia, de la actividad de iDIAm en comparación con la línea de base previa a la lesión. En particular, la actividad de la EMG cDIAm aumenta tanto en condiciones de vigilia como de anestesia. Los registros anestesiados del día 3 proporcionan la validación de que el C2SH inicial fue exitoso, pero se deben realizar análisis cuantitativos en animales despiertos. En animales despiertos, la actividad de DIAm EMG en el día 3 después de C2SH representa el punto de partida para la recuperación. La Figura 4B muestra que la actividad de iDIAm EMG está reducida, pero no ausente, en el día 3 en ratas despiertas.
En algunos casos, el C2SH no se acompaña de un cese total de la actividad EMG eupneica de iDIAm (Figura 5A). UnC2SH inadecuado ocurre en menos del 5% de todos los casos utilizando el enfoque descrito en el presente manuscrito; sin embargo, es esencial que se realice una evaluación de la actividad de DIAm EMG en el día 3 después de la C2SH en cada rata para validar el éxito de la C2SH. La figura 5A muestra un ejemplo de la actividad de DIAm EMG de una rata en el día 3 después de la lesión, en la que la C2SH fue inadecuada para eliminar la actividad eupneica de iDIAm EMG en el día 3. Es importante destacar que la validación de la eficacia delC2SH se realizó mientras el animal estaba anestesiado. La actividad continua de la EMG eupneica sugiere que al menos una parte de la vía bulboespinal ipsilateral descendente se salvó, lo que puede complicar la interpretación de los resultados. La Figura 5B muestra que la actividad de iDIAm EMG está reducida, pero no ausente, en el día 3 en ratas despiertas. Sin embargo, la preservación de las entradas descendentes ipsilaterales puede disminuir el déficit inicial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig01.jpg"> Figura 1: Marco conceptual. El grupo respiratorio ventral rostral (rVRG) envía entradas descendentes a las neuronas motoras frénicas de la médula espinal cervical (C3-C 5). La mayoría de estos axones descendentes inervan el grupo de neuronas motoras frénicas ipsilaterales, pero una pequeña fracción cruza la línea media para activar el grupo de neuronas motoras contralaterales. Inmediatamente después de un C2SH, se interrumpen las entradas descendentes del rVRG al grupo de neuronas motoras frénicas ipsilaterales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig02.jpg"> Figura 2: Actividad representativa de C2SH y DIAm EMG. (A) Se muestra la vista transversal de la médula espinal de la rata y el sitio trans (sombreado en rojo) con estructuras importantes etiquetadas. La lesión espinal se realiza insertando un cuchillo de disección justo debajo del punto donde entra la raíz dorsal y cortando hasta aproximadamente la línea media (área roja translúcida sombreada). Obsérvese el corte de los principales tractos motores en los funículos lateral y ventral, pero la preservación de los funículos dorsales. (B) La vista longitudinal, que representa el silenciamiento de la actividad de las neuronas motoras ipsilaterales, complementa las trazas de EMG en bruto utilizadas para la confirmación en tiempo real de una lesión satisfactoria (C). A medida que la médula espinal se lesiona, cesa la actividad EMG eupneica iDIAm, lo que sugiere que las entradas ipsilaterales a las neuronas motoras frénicas se han cortado; mientras tanto, el cDIAm EMG aumenta inmediatamente su actividad como se muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig03.jpg"> Figura 3: Fabricación de electrodos. Se muestra el proceso de fabricación de electrodos DIAm EMG. El proceso básico consistía en medir y cortar una longitud adecuada de alambre (Paso 1), atar un nudo de anclaje y pelar el aislamiento de la vía para exponer el electrodo (Paso 2), unir una aguja de calibre 25 al alambre (Pasos 3 y 4), doblar la aguja para darle una curvatura similar a una aguja de sutura quirúrgica (Paso 5), y quitar el aislamiento para exponer una parte del cable que se conectará al amplificador para registrar EMG (Paso 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig04.jpg"> Figura 4: Hemisección espinal exitosa. (A) La actividad de DIAm EMG se muestra en una rata anestesiada antes deC2SH y en el día 3 después de la lesión. No hay evidencia de actividad eupneica de iDIAm EMG en esta rata en el día 3 después de la lesión, lo que indica que el C2SH inicial fue exitoso. Obsérvese el aumento compensatorio de la actividad EMG de cDIAm y el aumento de la frecuencia respiratoria en comparación con la afección previa a la lesión. (B) La actividad de DIAm EMG se muestra en la misma rata en condiciones de vigilia no anestesizada en el día 3 después de C2SH. Existe una clara evidencia de una actividad reducida, aunque no completamente silenciada, de iDIAm EMG. Obsérvese el aumento compensatorio de la actividad EMG de cDIAm y el aumento de la frecuencia respiratoria en comparación con la afección previa a la lesión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig05.jpg"> Figura 5: Hemisección espinal fallida. (A) Se muestra la actividad de DIAm EMG en una rata anestesiada antes de C2SH y en el día 3 después de la lesión. En esta rata, la actividad eupneica de iDIAm EMG persistió en el día 3 después de la lesión, lo que indica que el C2SH inicial fue inadecuado. En consecuencia, esta rata fue excluida de los análisis posteriores de recuperación funcional. Obsérvese el aumento compensatorio de la actividad EMG de cDIAm a pesar de un C2SH infructuoso, pero un aumento mínimo de la frecuencia respiratoria. (B) La actividad de DIAm EMG se muestra en la misma corrida en condiciones de vigilia no anestesa en el día 3 después de C2SH. Existe evidencia de una reducción de la iDIAm EMG, un aumento de la actividad de cDIAm EMG y un ligero aumento de la frecuencia respiratoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas

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Evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas

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