Name: Perfilado del pH luminal en organoides gastrointestinales tridimensionales mediante microelectrodos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a medir el pH luminal en organoides gástricos humanos tridimensionales utilizando microelectrodos. Este método permite caracterizar la fisiología intraluminal con resolución espacial y temporal para estudiar infecciones por Helicobacter pylori.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Ellen Lauchnor, al Dr. Phil Stewart y a Bengisu Kilic por su trabajo previo y su asistencia con los microsensores deO2 ; Andy Sebrell por su formación en cultivo de organoides y micromanipulación; Lexi Burcham por su asistencia en el cultivo de organoides, la preparación de los medios, el registro de datos y la organización; y la Dra. Susy Kohout para consejos generales en electrofisiología. Nos gustaría agradecer a la Dra. Heidi Smith por su ayuda con las imágenes y reconocer a la Instalación de Bioimágenes del Centro de Ingeniería de Biopelículas de la Universidad Estatal de Montana, que cuenta con el apoyo financiero del Programa de Resonancia Magnética de la Fundación Nacional de Ciencias (2018562), el M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (77369LSRIP y W911NF1910288) y la Instalación de Nanotecnología de Montana (un miembro de NNCI apoyado por la subvención NSF ECCS-2025391).
Un agradecimiento especial a todo el equipo de Unisense que hizo posible este trabajo, especialmente al Dr. Andrew Cerskus, la Dra. Laura Woods, el Dr. Lars Larsen, el Dr. Tage Dalsgaard, la Dra. Line Daugaard, la Dra. Karen Maegaard y Mette Gammelgaard. La financiación de nuestro estudio fue proporcionada por las subvenciones R01 GM13140801 (D.B., R.B.) y UL1 TR002319 (K.N.L.) de los Institutos Nacionales de Salud, y un Premio de Expansión de Investigación de la Oficina de Investigación y Desarrollo Económico (D.B.) de la Universidad Estatal de Montana. La Figura 1A se creó con BioRender.

Este protocolo requiere organoides 3D de al menos 200 μm de diámetro que tengan un lumen distinto y que estén incrustados en una matriz extracelular artificial (ECM, por ejemplo, Matrigel). Los tejidos gástricos humanos para la derivación de organoides se obtuvieron con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Montana y el consentimiento informado de los pacientes que se sometieron a una endoscopia superior en Bozeman Health (protocolo # 2023-48-FCR, a D.B.) o como muestras exentas de gastrectomía de estómago entero o manga del Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (protocolo #DB062615-EX). La información sobre las líneas de organoides y los números de paso utilizados para este estudio se proporciona en la Tabla 1, y la composición del medio se enumera en la Tabla 2. Consultar los protocolos publicados previamente para la generación y mantenimiento de líneas de organoides gastrointestinales 6,26,27.
1. Preparación de organoides gástricos humanos para el perfilado de pH
<ol><li>Iniciar y mantener cultivos de organoides gástricos utilizando protocolos estándar. Mantener los organoides en placas de 24 pocillos en 500 μL de medio de expansión por pocillo (Tabla 2). Passage estableció líneas de organoides cada 5-7 días, transfiriéndolas a un plato con fondo de vidrio de 35 mm en preparación para los experimentos de perfil de pH. NOTA: Los cultivos de organoides para nuestros experimentos se derivan de preparaciones de glándulas gástricas, que se obtienen de tejido adulto como se describe anteriormente. Utilizamos un método de digestión tisular de colagenasa para aislar estas glándulas antes de que se suspendan en la MEC, como se describió anteriormente 25,28,29.</li>
	<li>A partir de cultivos de organoides en crecimiento activo en los pasajes 1-15, seleccione pocillos que contengan al menos 100 organoides (aproximadamente 2 millones de células) con diámetros entre 200 y 700 μm para su transferencia y expansión en placas de Petri de 3,5 mm.</li>
	<li>Mientras prepara los organoides para la siembra (pasos 1.4-1.8), deje que las alícuotas de la matriz extracelular (MEC) se descongelen en hielo durante al menos 45 minutos. Mantenga la ECM en hielo durante todo este protocolo para evitar la gelificación. Precaliente las placas de cultivo celular colocándolas en una incubadora de CO2 al 5% de 37 °C.</li>
	<li>Retire los medios de los pocillos y coseche los cultivos de organoides gástricos pipeteando PBS helado en cada gota de ECM y rascando el gel con la punta de una pipeta P1000. Pipetear el PBS con los fragmentos de ECM que contienen organoides en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 200 × g a 4 °C durante 5 min. Los fragmentos de ECM que contienen los organoides serán visibles como una capa en el fondo del tubo. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y pipetee 350 μL de tripsina-EDTA al 0,25% en cada tubo, mezclando suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 2-5 min.</li>
	<li>Después de la incubación con tripsina-EDTA, añadir 600 μL de DMEM helado con penicilina/estreptomicina a cada tubo y pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo al menos 40 veces. Centrifugar a 200 × g a 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Para configurar cultivos para mediciones de pH, vuelva a suspender el pellet de células en ECM líquido helado en una proporción de 1:4 v/v de pellet de organoide a ECM para el recubrimiento.</li>
	<li>Para cada muestra, coloque 40 μL de MEC líquida que contenga organoides/fragmentos de organoides en una delgada línea horizontal a lo largo del diámetro de una placa con fondo de vidrio de 35 mm. NOTA: Dispensar el gel en la placa en una línea en lugar de una gota redonda permite un acceso más fácil a los organoides individuales al diluir el cultivo.</li>
	<li>Deje que el gel polimerice durante 15-30 min; luego, agregue con cuidado 2 mL de medio de expansión de organoides a la placa pipeteando a lo largo del borde del pocillo para evitar alterar el gel.</li>
	<li>Reemplace los medios cada dos días. Espere de 4 a 8 días para que un mínimo de 10 organoides crezcan hasta un diámetro mínimo de 400 μm.</li>
	<li>Para continuar con un experimento de perfil de pH, asegúrese de que cada cultivo contenga al menos 10 organoides que cumplan con los siguientes criterios: >200 μm de diámetro, apariencia saludable (poco o ningún material oscuro visible dentro de los organoides observados con un microscopio de campo claro) y no abarrotado por otros organoides.</li>
</ol>2. Desempaquetado y calibración de microelectrodos
NOTA: Para permitir las mediciones a microescala, se utiliza un electrodo de referencia separado además del microelectrodo del sensor de pH en lugar de utilizar un diseño integrado (y, por lo tanto, más voluminoso). Tanto el microelectrodo de pH como el electrodo de referencia deben almacenarse húmedos. No permita la exposición al aire durante más de 10 minutos seguidos. Determine el tamaño de punta apropiado para la aplicación. En este caso, utilizamos un microelectrodo potenciométrico de pH con un diámetro de punta biselada de 25 μm.
<ol><li>Con el microelectrodo aún en su tubo de protección, inspeccione visualmente la punta para ver si hay algún daño.</li>
	<li>Conecte el electrodo de referencia al cable del electrodo de pH a través del conector. Luego, conecte el microelectrodo al amplificador y el amplificador a una PC conectada a tierra con el software a través de un cable USB (Figura 1A).</li>
	<li>Llene dos tubos cónicos de 50 mL 2/3 con etanol al 70% y H2O desionizado (diH2O). Coloque el microelectrodo y el electrodo de referencia en el tubo diH2O, asegurándose de que ambas puntas aparezcan sumergidas al menos 1 cm en el líquido. NOTA: Los vasos de precipitados altos también se pueden usar para este y otros pasos similares.</li>
	<li>Deje que los electrodos se equilibren durante ~ 10 minutos. NOTA: El procedimiento también puede pausarse en este paso y reanudarse más tarde, ya que los electrodos pueden almacenarse en diH2O.</li>
	<li>Mientras los electrodos se equilibran, abra el software (icono rojo) en la estación de trabajo de la computadora. En la pestaña Configuración, asegúrese de que la casilla junto al microelectrodo esté marcada, lo que indica que el software lo ha conectado correctamente y lo reconoce. Haga clic en Iniciar experimento en la parte superior izquierda de la ventana e introduzca el nombre de archivo y el destino que desee. En la ventana Configuración del sensor y del experimento , haga clic en Borrar todos los puntos para preparar el software para una nueva calibración.</li>
	<li>Llene dos tubos cónicos de 50 mL 2/3 con tampones de calibración de pH 4,01 y pH 9,21. Seque suavemente el tubo protector y el electrodo de referencia con una toallita delicada de laboratorio.</li>
	<li>Empezando por los electrodos del tampón de pH 4,01, introduzca 4,01 como valor de pH conocido. Una vez que la lectura de mV se haya estabilizado, seleccione agregar punto. Confirme que la señal es estable a ~380 mV. Después de haber agregado la punta, vuelva a colocar ambos electrodos en diH2O para enjuagar, luego seque nuevamente.</li>
	<li>Repita el paso anterior con el búfer 9.21 y haga clic en agregar punto cuando la señal sea estable (~83 mV). Comprobar que los microelectrodos responden linealmente entre pH 4,01 y 9,21; Por lo tanto, solo es necesaria una curva de calibración de dos puntos. Asegúrese de que la línea resultante entre estos puntos tenga una pendiente negativa de 50-70 mV/unidad de pH. Haga clic en Guardar y usar calibración. NOTA: Ahora está listo para comenzar a registrar las mediciones30.</li>
</ol>3. Perfil de pH de organoides gástricos humanos
NOTA: Se describe el siguiente protocolo para un usuario diestro. PRECAUCIÓN: Deshabilite todas las opciones de ahorro de energía en su PC, ya que las mediciones en curso se interrumpirán si la PC entra en modo de suspensión.
<ol><li>Ensamble un soporte de anillo con una abrazadera en el lado izquierdo de un microscopio estereoscópico para sostener el electrodo de referencia. Coloque un micromanipulador conectado a un soporte de laboratorio pesado en el lado derecho del microscopio (Figura 1A).</li>
	<li>Retire con cuidado el microelectrodo de su estuche de protección colocándolo plano sobre el banco y tirando del estuche con un movimiento rápido y rápido. PRECAUCIÓN: Los microelectrodos son increíblemente frágiles y se debe tener cuidado para garantizar que la punta no entre en contacto con material rígido y sólido. Para obtener los mejores resultados, realice las mediciones en una mesa de trabajo resistente y libre de equipos que puedan causar vibraciones en el banco o movimientos no deseados de los electrodos.</li>
	<li>Monte el microelectrodo en un micromanipulador y coloque el estereoscopio y el micromanipulador de tal manera que el microelectrodo pueda avanzar hacia la placa de cultivo sin golpear el objetivo u otras partes del microscopio.</li>
	<li>Coloque la placa de cultivo que contiene los organoides para tener una visualización adecuada del primer organoide que se va a perfilar (Figura 1B).</li>
	<li>Fije ligeramente el electrodo de referencia a la pinza del soporte de anillo a la izquierda del estereoscopio. Coloque el electrodo de referencia de modo que descanse en el medio que rodea el ECM. Tenga cuidado de asegurarse de que no interrumpa los organoides a medida que la etapa se mueve entre mediciones.</li>
	<li>Mirando directamente a la placa de cultivo (no al microscopio), avance la punta del microelectrodo hasta que esté suficientemente sumergido en el medio. En la pestaña Registrador de datos del software, haga clic en el botón Inicio (un solo triángulo apuntando a la derecha) para comenzar a grabar. Asegúrese de que la casilla de verificación Calibrado esté seleccionada en el lado derecho de la pantalla. NOTA: Espere ~10 s para que cada lectura se estabilice antes de avanzar a la siguiente región.</li>
	<li>Antes de ingresar al ECM, asegúrese de que la punta del electrodo sea visible bajo el microscopio y que esté posicionada para avanzar linealmente hacia el primer organoide de interés. Avance lentamente el electrodo en el gel, sin entrar en contacto con ningún organoide. Registre al menos tres lecturas de pH y calcule el promedio.</li>
	<li>Coloque el microelectrodo de modo que esté preparado para avanzar hacia el primer organoide de interés a lo largo del eje perpendicular a la superficie. Permita que el electrodo haga una pequeña hendidura en la superficie epitelial sin penetrar (Figura 1C). NOTA: Este paso también proporcionará información sobre si el organoide permanecerá en su lugar o si puede moverse más libremente en el ECM.</li>
	<li>Con un movimiento rápido, avance el microelectrodo en el organoide. Si el organoide se mueve alrededor del microelectrodo o se aleja, intente un ángulo ligeramente diferente o respalde contra otro organoide o el borde de plástico que rodea el fondo del cubreobjetos de la placa. Mida el pH luminal (tres veces individuales) de 10 organoides diferentes para cada condición experimental. Cuando termine de registrar las mediciones, haga clic en el botón cuadrado Detener. PRECAUCIÓN: Estime el diámetro del organoide para decidir cuánto avanzar el electrodo en la luz del organoide, teniendo cuidado de no perforarlo. Para una mayor precisión, mida el diámetro con el software de la cámara de su microscopio, si está disponible. NOTA: Si la punta del microelectrodo se cubre notablemente con residuos después de una o varias mediciones, lave el microelectrodo en una solución de disociación celular, PBS, EtOH y luego diH2O antes de continuar.</li>
</ol>4. Perfilado motorizado (opcional)
NOTA: Esta opción requiere un micromanipulador que está montado en una etapa de motor mecánico, que en última instancia es controlado por un software de computadora a través de un controlador de motor31.
<ol><li>Abra el software de generación de perfiles (icono marrón) e inicie un nuevo experimento en la pestaña Generación de perfiles .</li>
	<li>La configuración del eje z reconocerá automáticamente el motor cuando un aparato de motor esté conectado correctamente. NOTA: El movimiento en las direcciones x e y todavía se controla manualmente con esta configuración.</li>
	<li>Localice la pestaña Interacción del perfil30. Antes de pulsar el botón de inicio, asegúrese de que es posible pasar rápidamente a mirar el ocular del microscopio para garantizar la entrada del organoide a la distancia deseada. Vaya a Configuración del perfil y haga lo siguiente:<ol><li>Indica que la distancia de inicio es de 0 μm. PRECAUCIÓN: Si la cubierta epitelial es particularmente dura para un organoide dado, el organoide puede ser empujado o deformado en lugar de penetrar. Si se da el caso de empuje, continúe avanzando el electrodo, pero tenga en cuenta el punto en el que se produce la entrada, ya que el software no puede registrarla automáticamente.</li>
		<li>A juzgar por el tamaño del organoide que se perfila, indica una distancia final que no supere los 3/4 del diámetro estimado de un organoide. NOTA: Este paso en particular está diseñado para evitar daños en la punta del electrodo.</li>
		<li>Indique el tamaño de paso deseado: 100 μm, como se muestra en la Figura 2E. Asegúrese de que el tamaño mínimo del paso coincida con el tamaño de la punta del electrodo (por ejemplo, 25 μm para una punta de electrodo de 25 μm pH-25).</li>
		<li>Indique una posición segura a la que el motor devolverá la punta del electrodo entre los perfiles. NOTA: Debe estar a una altura cómoda por encima de la muestra (fuera del organoide) en la que el sensor pueda moverse de forma segura hacia los lados en las direcciones x e y con el micromanipulador manual. Deje el ángulo del sensor en su configuración predeterminada.</li>
		<li>Para permitir que el electrodo se equilibre, indique al menos 3 s en Esperar antes de las mediciones.</li>
		<li>Establezca los períodos de medición en al menos 1 s. Se promediarán las mediciones durante este período. NOTA: Si realiza mediciones en un entorno con alto nivel de ruido eléctrico, puede ser útil indicar un período más largo.</li>
		<li>Establezca el retardo entre(s) en al menos 1 s.</li>
		<li>Establezca el número preferido de réplicas que se medirán en cada profundidad.</li>
		<li>Comience a registrar las mediciones pulsando el botón Inicio .</li>
	</ol></li>
</ol>5. Limpieza de electrodos
<ol><li>Vuelva a colocar el electrodo a limpiar en su tubo de protección.</li>
	<li>Enjuague los electrodos con diH2O después de las mediciones.</li>
	<li>Enjuague los electrodos con etanol al 70% durante un par de minutos.</li>
	<li>Enjuague los electrodos con tampón de pH 4.01.</li>
	<li>Enjuague los electrodos una vez más con diH2O antes de continuar con las mediciones.</li>
</ol>6. Almacenamiento de electrodos
NOTA: Ambos electrodos deben almacenarse a temperatura ambiente en un lugar de baja actividad, a salvo de daños accidentales.
<ol><li>Después de usar el microelectrodo de pH, deslícelo con cuidado horizontalmente hacia atrás en su tubo de protección (deslizándolo a lo largo de la mesa de laboratorio para soporte horizontal).</li>
	<li>Sosteniendo el microelectrodo en posición vertical (con la punta apuntando hacia arriba), llene suavemente el tubo de protección con agua estéril. Tape el tubo de protección con el tapón con el que vino el electrodo. Asegúrese de que los orificios del tubo de protección estén sellados con cinta aislante. Guárdelo en una caja irrompible hasta el próximo uso. NOTA: Se recomienda utilizar la caja original en la que venían los electrodos, ya que contendrá insertos protectores diseñados para mantener los electrodos en su lugar cuando se almacenan.</li>
	<li>Guarde el electrodo de referencia en un vaso de precipitados o cilindro graduado lleno de una solución de KCl de 3M. Cubra el vaso de precipitados/cilindro graduado con parafilm para evitar la evaporación de la solución. NOTA: Si utiliza un cilindro graduado, se recomienda asegurarlo a la mesa de laboratorio con cinta adhesiva para evitar movimientos accidentales.</li>
</ol>7. Inyección de rojo de metilo (opcional)
NOTA: El rojo de metilo es un colorante indicador colorimétrico que se puede utilizar para validar las mediciones de microelectrodos.
<ol><li>Rellene un capilar de vidrio de 2 μL con aceite mineral estéril, cárguelo en un autoinyector de nL controlado por micromanipulador y, posteriormente, llénelo con una solución que contenga 0,02% de rojo de metilo y 150 mM de HCl. NOTA: La solución debe aparecer de color rojo/rosado mientras está en el capilar debido a la acidez del HCl.</li>
	<li>Inyectar organoides de al menos 300 μm de diámetro con 9,2 μL de la solución25.</li>
	<li>Captura de imágenes o vídeo utilizando una cámara adaptada al microscopio estereoscópico (Figura 2G).</li>
</ol>

Medición precisa del pH luminal en organoides gástricos 3D con microelectrodos

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<li>Guimera, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+invasive+microsensor+specially+designed+for+simultaneous+dissolved+oxygen+and+ph+biofilm+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling.</a> Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El acceso limitado al espacio luminal de los organoides ha restringido severamente nuestra comprensión de la dinámica fisiológica de este microambiente. Una herramienta fiable para los análisis funcionales de la fisiología luminal ampliará nuestra capacidad de aprovechar los organoides como modelos in vitro para la fisiología, la farmacología y la investigación de enfermedades. Los organoides son modelos altamente ajustables, fisiológicamente relevantes, con el potencial añadido de replicar la variabilidad genética dentro de la población humana. Los métodos existentes para la medición del pH dentro de la luz del organoide han utilizado colorantes sensibles al pH o nanopartículas, métodos que a menudo deben combinarse con microscopía de fluorescencia o espectroscopía 16,17,37. El método de perfil basado en microsensores descrito proporciona una nueva ruta para medir el pH intraluminal de los organoides gastrointestinales con una nueva precisión espacial. Nuestro método demuestra una medición consistente y confiable del pH luminal del organoide gastrointestinal, así como evidencia de un gradiente de pH. En experimentos no publicados, confirmamos la expresión de los genes de la familia SLC SLC4A2 y 26A7, que se sabe que son responsables de la secreción de bicarbonato, así como SLC9A3, 9A4 y 9A8 que son responsables del intercambio de protones (Figura suplementaria S1)38,39,40,41. Nuestros estudios sugieren un predominio de la secreción de bicarbonato y una ausencia de células parietales en nuestros organoides, lo que puede explicar la alcalinidad.
Es importante asegurarse de que los microelectrodos utilizados sean adecuados para el microperfilado de organoides, lo que incluye seleccionar el diámetro correcto de la punta. Probamos puntas de 25 μm y 50 μm y obtuvimos resultados similares (Figura 2A), pero decidimos seguir adelante con el tamaño de punta más pequeño según el consejo del fabricante, ya que se esperaba que fuera menos invasivo y proporcionara una resolución espacial más alta, ya que las mediciones se promedian en el área de la punta biselada. Sin embargo, como desventaja, las puntas más pequeñas son más frágiles. El tamaño del organoide debe tenerse en cuenta para determinar la resolución espacial deseada.
Un paso crítico en el protocolo fue garantizar la capacidad de distinguir entre el pH intraluminal del organoide del pH en la MEC y, posteriormente, en el medio de cultivo circundante. Uno esperaría una cantidad razonable de flujo de metabolitos dentro y fuera de los organoides42. Esperamos que el pH de un organoide esté influenciado por su entorno y descubrimos que los organoides eran consistentemente menos alcalinos que su entorno en seis experimentos independientes (Figura 2D). Además, la estabilidad es tan importante en el perfilado como lo es durante la calibración del sensor.
Se espera que los organoides derivados de tejidos presenten un cierto grado de variabilidad entre donantes, por lo que es esencial perfilar cualquier línea de organoides al inicio del estudio antes de aplicar cualquier intervención experimental, como el tratamiento farmacológico43. Nuestra hipótesis es que las fluctuaciones en el pH dentro de cualquier cultivo de organoides pueden deberse a gradientes iónicos locales a microescala y a la distribución heterogénea del moco luminal determinada por inmunofluorescencia y tinción inmunohistoquímica (datos no publicados). Las variaciones observadas en el pH entre las líneas y los pasajes de organoides individuales pueden deberse a diferencias individuales en la composición celular y la actividad secretora de los organoides. También encontramos que algunas líneas de organoides eran inherentemente más difíciles de penetrar que otras. De manera similar, algunos pueden perder su integridad estructural y colapsar al ingresar el electrodo (Figura complementaria S2 y video complementario S1). Esto no parece estar asociado con el paso de organoides, pero se ha observado más comúnmente en organoides de más de ~ 1,5 mm de diámetro. En un estudio previo, demostramos que el moco dentro de los organoides estaba distribuido de manera heterogénea29. Debido a esta heterogeneidad, se hace difícil determinar si la distribución de moco ha afectado a una medición (o en qué medida).
Los microsensores son herramientas mínimamente invasivas que pueden perfilar la fisiología intraluminal de los organoides con alta velocidad y alta resolución espacial. Estos sensores tampoco alteran los gradientes químicos y son mínimamente sensibles a las turbulencias en el microambiente de interés. El diseño pequeño es posible gracias a la separación del electrodo sensor del electrodo de referencia: las sondas de pH estándar de laboratorio combinan estos dos electrodos, lo que da lugar a un tamaño más grande. El grupo Cash de la Escuela de Minas de Colorado ha desarrollado nanosensores ópticos de pH yO2 para mediciones intracelulares y han tenido éxito en la medición de metabolitos tanto en modelos de ratón como de biopelícula. Sin embargo, debido a la heterogeneidad en la luz del organoide, estos sensores pueden conducir a resultados ininterpretables17. McCracken et al. analizaron el pH luminal en organoides gástricos derivados de células madre embrionarias inyectando SNARF-5F y visualizando el tinte sensible al pH con microscopía confocal en tiempo real37. En particular, las mediciones reportadas por McCracken fueron muy similares a los valores de pH obtenidos en nuestro estudio actual (Figura 2B,C). Nuestra técnica podría aplicarse en una arquitectura monocapa, con una configuración más vertical como en el perfilado de biopelículas, aunque esto puede suponer un riesgo de dañar los electrodos44. Los estudios futuros también podrían incluir mediciones secuenciales del pH durante varios días para evaluar los cambios asociados con el desarrollo celular. Dado que los organoides de tamaño mediano generalmente se recuperan y sanan después del sondeo, un organoide podría teóricamente ser sondeado varias veces, siempre y cuando se pueda mantener la esterilidad de los cultivos. A medida que refinamos nuestra comprensión de la dinámica del pH en modelos de organoides, la resolución espacial debe ser una prioridad para el mapeo preciso del complejo e históricamente inaccesible microambiente 3D que contiene.
En resumen, este protocolo proporciona un método detallado para mediciones precisas de pH con alta resolución espacio-temporal utilizando microelectrodos de pH montados en un micromanipulador y un microscopio estereoscópico. Este método se validó con organoides derivados de células madre adultas humanas y es adecuado para organoides epiteliales de al menos 200 μm de diámetro que tienen un lumen distinto. Anticipamos que al seleccionar microelectrodos alternativos, este método se puede adaptar fácilmente a otros tipos de organoides y a la medición de compuestos alternativos, como el NO o elO2.

Los organoides, estructuras multicelulares en miniatura derivadas de células madre, han revolucionado nuestra capacidad para estudiar la fisiología humana y están comenzando a reemplazar a los modelos animales, inclusoen entornos regulatorios. Desde la descripción inicial de los organoides intestinales por Sato et al. en 2009, la tecnología de organoides se ha vuelto inmensamente popular2. Un gran número de estudios han caracterizado con gran detalle la composición celular y la función de los modelos de organoides 3,4,5,6. Sin embargo, el espacio luminal de estas estructuras multicelulares 3D sigue siendo en gran medida indefinido 7,8. La luz es la cavidad central de los organoides derivados de los tejidos mucosos que está rodeada por las porciones apicales de las células epiteliales polarizadas. Dado que la secreción y absorción celular ocurre predominantemente en la superficie epitelial apical, el microambiente luminal de los organoides está controlado por estos importantes procesos fisiológicos. Los modelos de organoides utilizados actualmente demuestran variaciones en los patrones de señalización celular, la talla general, los gradientes de concentración de metabolitos y las condiciones ambientales9. Por lo tanto, la comprensión de la fisiología luminal de los organoides es necesaria para el modelado preciso de la función y la patología de los órganos. Desafortunadamente, la relativa inaccesibilidad del lumen dificulta significativamente los análisis funcionales de la fisiología luminal en organoides 3D10.
La capacidad de examinar los perfiles de pH es especialmente importante en el estómago, que es conocido por tener el gradiente de protones más pronunciado del cuerpo, que va desde aproximadamente 1-3 en el lumen, hasta casi neutro en el epitelio 11,12,13. Sigue habiendo una brecha significativa en nuestra comprensión del mantenimiento a microescala del gradiente de pH gástrico y la relevancia de los modelos de organoides para recapitular este entorno dinámico a través de la capa de moco gástrico. Los enfoques tradicionales para el análisis del pH de los organoides han implicado el uso de colorantes sensibles al pH, que pueden ser fluorescentes o indicadores colorimétricos. McCracken et al. utilizaron una inyección luminal de SNARF-5F, un indicador de pH radiométrico, en organoides para analizar una caída en el pH luminal en respuesta al tratamiento con histamina. Dichos colorantes se pueden incorporar a los medios de cultivo, lo que permite un monitoreo no invasivo y en tiempo real del pH. Los colorantes sensibles al pH no solo requieren pasos de calibración complejos que contribuyen a una baja confiabilidad y precisión en las mediciones, sino que dichos colorantes también tienden a operar dentro de rangos de detección específicos que pueden no ser representativos del rango de pH completo dentro del microambiente de interés14,15. Sin embargo, podría considerarse razonable utilizar tintes indicadores para experimentos confirmatorios. También se han desarrollado nanosensores ópticos que utilizan enfoques de detección de pH basados en optódos fluorescentes; Sin embargo, estas técnicas de detección requieren imágenes microscópicas y también son susceptibles al fotoblanqueo, a la fototoxicidad y al sesgo de las imágenes16,17. Además, Brooks et al. tienen placas multipocillos impresas en 3D que contienen microelectrodos sobre los cuales se pueden recubrir organoides18. Este enfoque, sin embargo, no permite mediciones directamente dentro del lumen del organoide.
Las mediciones de pH basadas en electrodos pueden lograr una precisión mejorada en comparación con otros métodos, así como proporcionar un monitoreo de pH en tiempo real. Además, los electrodos de pH montados en micromanipuladores permiten una resolución espacial superior de las mediciones de pH, ya que la ubicación precisa de la punta del electrodo se puede controlar con precisión. Esto permite la mayor flexibilidad y reproducibilidad posible en los análisis de modelos de organoides. Los electrodos utilizados aquí son microelectrodos de pH miniaturizados que funcionan en base a la difusión de protones a través de un vidrio de pH selectivo que rodea un delgado alambre de platino. El microelectrodo se conecta a un electrodo de referencia Ag-AgCl externo y luego se conecta a un medidor de milivoltios de alta impedancia. El potencial eléctrico entre las dos puntas de los electrodos cuando se sumergen en la misma solución reflejará el pH de la solución19. Estos sistemas de microperfilado se han utilizado en el análisis metabólico de biopelículas20,21, algas planctónicas22, muestras de esputo humano23 e incluso en esferoides de células madre mesenquimales24. Tanto nuestro laboratorio como Murphy et al. han utilizado previamente microelectrodos deO2 controlados por micromanipuladores para evaluar las concentraciones de oxígeno en los espacios luminales de los organoides. Murphy et al. combinaron este método con modelos matemáticos para revelar un gradiente de oxígeno dentro de sus esferoides. Nuestro grupo fue capaz de encontrar niveles reducidos de oxígeno luminal en organoides gástricos derivados de tejidos en comparación con la matriz extracelular circundante25.
Aquí, proporcionamos un método detallado para el perfil manual de microelectrodos del pH luminal en organoides esféricos del tracto gastrointestinal que permitirá una mejor comprensión fisiológica de su complejo microambiente luminal. Anticipamos que esta técnica agregará una nueva dimensión a la exploración de la fisiología de los organoides a través de mediciones en tiempo real y de alta resolución de los niveles de pH a microescala. Además, el siguiente protocolo podría adaptarse fácilmente para el análisis deO2,N2, O,H2, NO,H2, Redox y temperatura en varios tipos de modelos de organoides. El perfil fisiológico sirve como una herramienta valiosa para optimizar las condiciones de cultivo de organoides para imitar mejor los entornos in vivo , mejorando así la relevancia y utilidad de los modelos de organoides en la investigación biomédica.

<table><tbody><tr><td>3 M KCl</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta Serológica sin Bamboleo, Envuelta Individualmente, Papel/Plástico, Bolsa, Estéril</td><td>CellTreat</td><td>229091B</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta Serológica sin Bamboleo, Envuelta Individualmente, Papel/Plástico, Bolsa, Estéril</td><td>CellTreat</td><td>229092B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo de Centrífuga - Estante de Espuma,</td><td>Estéril CellTreat</td><td>229412</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos,</td><td>CellTreat</td> estéril <td>229124</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipeta serológica sin bamboleo, envuelta individualmente, papel/plástico, bolsa,</td><td>CellTreat</td><td>estéril 229093B</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 35 mm | Nº 1.5 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 20 mm | Tubo</td> de centrífuga <td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr> de <tr><td>50 mL sin recubrimiento - Estante de espuma,</td><td>CellTreat</td> estéril <td>229422</td><td></td></tr><tr><td>etanol al 70%</td><td></td><td>BP82031GAL BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro de células, envuelto individualmente, estéril</td><td>CellTreat</td><td>229483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.000 y micro; l Puntas de pipeta de baja retención de longitud extendida, en estanterías, estériles</td><td>CellTreat</td><td>229037</td><td></td></tr><tr><td>solución de anfotericina B (Fungizone)</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad</td><td>Nuaire&nbsp;</td><td>NU-425-600</td><td>Clase II Tipo A/B3</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Solución de recuperación</td> celular <td>Corning</td><td>354253</td><td>Solución de disociación celular</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (DMEM avanzado)</td><td>Gibco</td><td>12-491-015</td><td></td></tr><tr><td>Modificación de Dulbecco del medio Eagles (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15017CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfato</td><td>Corning</td><td>30-234-CR</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Ácido Libre</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>HP Pavillion 2 en 1 14" Portátil Intel Core i3</td><td>HP</td><td>M03840-001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Incubadora Scientific</td><td>A144C-212</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11676604</td><td></td></tr><tr><td>cámara iPhone 12</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>grande Kimberly-Clark Profesional Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas, 1 capa</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>M 205 FA Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de Membrana 354234</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>MC-1 Controlador UniMotor</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rojo</td><td></td><td></td><td></td>de metilo</tr><tr><td>MM33 Micromanipulador</td><td>Marzhauser Wetzlar</td><td>61-42-113-0000</td><td></td></tr><tr><td>Diestro MS-15 Escenario Motorizado Unisense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject-II</td><td>Autoinyector de nanolitros</td> <td>Drummond</td><td>3-000-204</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrodos de pH</td><td>Unisense</td><td>50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160</td><td>El software SensorTrace no es compatible con las computadoras Apple</td></tr><tr><td>Electrodo de referencia</td><td>Unisense</td><td>REF-RM-001652</td><td>El software SensorTrace no es compatible con Ordenadores Apple</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de cámara para smartphone</td><td>Gosky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Especificaciones Soporte de laboratorio LS</td><td>Unisense</td><td>LS-009238</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,025%, rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>UniAmp</td><td>Unisense</td><td>11632</td><td></td></tr><tr><td>United Biosystems Inc&nbsp; MINI RASCADORES DE CÉLULAS 200/PK</td><td>Fisher</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato</td><td>Tocris Bioscience</td><td>12-541-0</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Kit de calibración de sensor</td><td>Unisense/ Mettler Toledo</td><td>51-305-070, 51-302-069</td><td>pH 4.01 y 9.21, paquetes de 20 mL</td></tr></tbody></table>

perfilado del ph luminal en organoides gastrointestinales tridimensionales mediante microelectrodos

Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes

La optimización y caracterización detallada de modelos de organoides gastrointestinales requiere métodos avanzados para analizar sus entornos luminales. Este artículo presenta un método altamente reproducible para la medición precisa del pH dentro de la lumina de organoides gástricos humanos en 3D a través de microelectrodos controlados por micromanipuladores. Los microelectrodos de pH están disponibles en el mercado y consisten en puntas de vidrio biseladas de 25 μm de diámetro. Para las mediciones, el microelectrodo de pH se introduce en el lumen de un organoide (>200 μm) que está suspendido en Matrigel, mientras que un electrodo de referencia descansa sumergido en el medio circundante en la placa de cultivo. 
Utilizando estos microelectrodos para perfilar organoides derivados del cuerpo gástrico humano, demostramos que el pH luminal es relativamente consistente dentro de cada cultivo bien a ~7,7 ± 0,037 y que se pueden obtener mediciones continuas durante un mínimo de 15 min. En algunos organoides más grandes, las mediciones revelaron un gradiente de pH entre la superficie epitelial y el lumen, lo que sugiere que las mediciones de pH en organoides se pueden lograr con alta resolución espacial. En un estudio anterior, los microelectrodos se utilizaron con éxito para medir las concentraciones de oxígeno luminal en organoides, lo que demuestra la versatilidad de este método para el análisis de organoides. En resumen, este protocolo describe una herramienta importante para la caracterización funcional del espacio luminal complejo dentro de organoides 3D.

La secreción de ácido es una función crucial del estómago humano. Sin embargo, hasta qué punto la secreción ácida puede modelarse en organoides sigue siendo un tema de debate 6,32,33,34. Por lo tanto, desarrollamos el protocolo detallado anteriormente para medir con precisión la producción de ácido en organoides gástricos. En particular, utilizamos organoides derivados de células madre adultas no estimuladas cultivadas en condiciones de expansión estándar que habían sido aprobadas varias veces, lo que condujo a la pérdida de células parietales35. Por lo tanto, no se esperaba la presencia de células parietales secretoras de ácido y la liberación activa de ácido en nuestro sistema modelo.
Para nuestros experimentos, utilizamos organoides con diámetros entre 200 μm y 1.000 μm sembrados en platos con fondo de vidrio. En primer lugar, probamos dos tamaños de punta diferentes para los microelectrodos: un pH-25 con un diámetro de punta de 25 μm y un pH-50 con un diámetro de punta de 50 μm. Como se muestra en la Figura 2A, no hubo diferencia significativa entre las mediciones obtenidas con las puntas más pequeñas en comparación con las más grandes. Curiosamente, el pH basal en los organoides tendía a ser ligeramente alcalino a ~pH 8. Utilizando la punta de 25 μm pH-25, evaluamos la variación del pH luminal dentro de diferentes diez organoides mantenidos en la misma placa de cultivo, con tres mediciones obtenidas de cada organoide (Figura 2B). Dentro de una placa, el pH luminal de los organoides individuales mostró solo ligeras variaciones no significativas (8,16 ± 0,12; p ≥0,0445-0,99) (Figura 2B). También comparamos las mediciones de pH intraluminal dentro de cinco líneas de organoides diferentes con pasajes que van de 3 a 16 (Figura 2C). Una vez más, encontramos mediciones de pH consistentes dentro de cada cultivo, pero una variabilidad significativa entre las líneas de organoides. Sin embargo, el pH luminal generalmente se mantuvo entre pH 7.3 y pH 8.2, dentro de un orden de magnitud, y no hubo una tendencia aparente para el pH promedio cuando se compararon los números de paso temprano con el tardío (Figura 2C). A continuación, nos preguntamos si el pH de la luz del organoide estaba directamente relacionado con el pH del medio de expansión del organoide y la matriz extracelular (MEC). La comparación entre los medios, la MEC que rodea a los organoides y la luz del organoide reveló diferencias significativas en el pH, con el pH luminal de los organoides más bajo que el de la MEC y el pH de la MEC más bajo que el de los medios de expansión del organoide circundante (Figura 2D), lo que sugiere que el pH luminal de los organoides era fisiológicamente relevante en lugar de estar determinado directamente por el entorno de cultivo. A través de seis experimentos independientes, medimos un pH luminal promedio que era casi neutro de 7,13 ± 0,09.
Se utilizó un micromanipulador motorizado para obtener mediciones de pH del lumen del organoide con mayor resolución espacial. Este enfoque es relevante si es necesario registrar el pH u otros gradientes dentro de la luz del organoide29 lleno de moco. La Figura 2E muestra dos series representativas de mediciones de pH en organoides grandes (&gt;1.000 μm de diámetro), que muestran el punto de entrada en cada organoide y terminan a una profundidad de ~800 μm. Como los dos organoides perfilados no tenían el mismo diámetro, las mediciones no son inmediatamente comparables. De todos modos, mostramos evidencia de un ligero gradiente de pH de Δ0.6 entre la superficie epitelial y la luz organoide más profunda (Figura 2E). Para determinar la factibilidad de realizar mediciones de pH en los organoides a lo largo del tiempo, lo que permitiría medir las respuestas al tratamiento en tiempo real, registramos el pH intraluminal dentro de un organoide representativo durante aproximadamente 20 min y encontramos que la lectura se mantuvo altamente consistente después de un período de adaptación inicial (Figura 2F). Para validar las mediciones del pH luminal con un método independiente, utilizamos un colorante colorimétrico sensible al pH (rojo de metilo) que inyectamos en el lumen del organoide utilizando un autoinyector de nanolitros montado en un micromanipulador (Figura 2G). La coloración amarilla del colorante confirmó que la luz del organoide tenía un pH &gt;6,2, lo que concuerda con las mediciones de los microelectrodos que mostraron un pH casi neutro. En general, estos resultados representativos ilustran la viabilidad y reproducibilidad de las mediciones de pH basadas en microelectrodos en cultivos de organoides.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del método. (A) Diagrama esquemático de la configuración del perfilado. El microelectrodo de la Figura 1A fue tomado del sitio web de Unisense. 36 (B) Imagen representativa del cultivo de organoides listo para el perfilado, el ECM circundante y los medios circundantes (barra de escala = 5 mm). (C) Ejemplo de posicionamiento correcto de microelectrodos en preparación para el sondeo de organoides (barra de escala = 500 μm). Abreviatura: ECM = matriz extracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig02.jpg"> Figura 2: Validación del perfil de microsensores en organoides gástricos humanos. (A) Comparación de mediciones de pH de lúmenes medios utilizando puntas de microelectrodos de 25 μm (pH-25) y 50 μm (pH-50). Datos de 10 organoides individuales, cada uno de un único experimento representativo. (B) Se obtuvieron tres mediciones de pH repetidas para 10 organoides individuales. ANOVA de un factor con comparaciones múltiples (p = 0,1229). (C) Las mediciones de pH obtenidas con un electrodo de pH-25 son consistentes dentro de cada una de las cinco líneas de organoides analizadas con diferentes números de paso; Se miden de 4 a 10 organoides por línea según el tamaño y la disponibilidad. ANOVA de un factor con comparaciones múltiples (p &lt; 0,0001). (D) Mediciones de pH dentro de los organoides gástricos y el Matrigel y los medios circundantes (n = 6 experimentos independientes). Mediciones obtenidas por penetración de organoides epiteliales gástricos con un pH-25. Cada punto de datos es la media de 10 mediciones individuales de pH dentro de un solo organoide. ANOVA de un factor (p &lt; 0,0001). (E) Perfiles de pH epitelial a lúmene de dos organoides representativos utilizando un micromanipulador motorizado. (F) Estabilidad del pH a lo largo del tiempo (~19,8 min) en un organoide representativo. (G) Microinyección de rojo de metilo, colorante indicador de pH y HCl en la luz del organoide gástrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Donante</td>
		</tr><tr><td>Figura</td>
			<td>Línea</td>
			<td>Pasaje</td>
			<td>Sexo</td>
			<td>Edad</td>
			<td>Origen étnico</td>
		</tr><tr><td>2A</td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2B</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>44</td>
			<td>Desconocido</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2C</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2D</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Desconocido</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>37</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Desconocido</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>31</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>H</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>9</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2E</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>43</td>
			<td>Desconocido</td>
		</tr><tr><td>2F</td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>33</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>2G</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Medio de expansión de organoides gástricos humanos (L-WRN)</td>
		</tr><tr><td>Medio acondicionado L-WRN</td>
			<td>50%</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avanzado</td>
			<td>37%</td>
		</tr><tr><td>Suero fetal bovino</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>L-glutamina</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Anfotericina B</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Búfer HEPES</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>Y-27632</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>SB-431542</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2.
Figura suplementaria S1: Expresión de transportadores iónicos en organoides gástricos humanos. Números relativos de copias normalizados a ARNr 18S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240425%20Supplemental%20Figure%201%20Revised.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Organoide gástrico humano con arquitectura deformada tras la punción con la sonda del microsensor de pH. Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario S1: Intento fallido de perfilado en un cultivo de organoides gástricos. El microelectrodo de pH de 25 μm se avanza manualmente hacia el organoide de interés. Después de un intento fallido debido a un error de cálculo del ángulo, se intenta un ángulo diferente y se revela que el organoide carece de la integridad estructural para ser perfilado (la estructura esférica no es robusta y se deforma al penetrar con el electrodo). A continuación, el usuario redirige para intentar un organoide diferente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El presente protocolo describe las mediciones de pH en organoides gástricos derivados de tejidos humanos utilizando microelectrodos para la caracterización espacio-temporal de la fisiología intraluminal.

Perfilado del pH luminal en organoides gastrointestinales tridimensionales mediante microelectrodos

The optimization and detailed characterization of gastrointestinal organoid models require advanced methods for analyzing their luminal environments. This ...

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Investigación

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Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

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Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

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