Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

Las vesículas extracelulares circulantes como biomarcadores son un campo relativamente nuevo en la investigación de biomarcadores con un inmenso potencial. Nuestro protocolo tiene como objetivo proporcionar un enfoque práctico para implementar el descubrimiento y la detección de biomarcadores unidos a vesículas extracelulares en un entorno de servicio de emergencias. La evidencia emergente ha demostrado que la carga molecular que se encuentra en las vesículas extracelulares y la circulación contiene proteínas y ARN de interés en múltiples contextos de enfermedad.

Varios nuevos biomarcadores de vesículas extracelulares encerrados se han relacionado con el diagnóstico y el pronóstico de diversas entidades de enfermedad cardiovascular. Los principales desafíos en el campo del descubrimiento de biomarcadores de vesículas extracelulares circulantes son la preservación de las vesículas extracelulares y la adquisición de plasma que depende de la dinámica de liberación de EV. Por lo tanto, es necesario un protocolo estricto integrado en la rutina clínica para evitar la degradación de EV y mantener resultados reproducibles, particularmente cuando se aplican métodos de análisis a gran escala como la proteómica.

El descubrimiento de biomarcadores proteicos encerrados en el EV circulante depende en gran medida del momento de la extracción inicial de sangre en relación con el inicio de los síntomas y de la duración del almacenamiento de la muestra debido a la degradación natural del EV. Este protocolo ofrece un protocolo práctico de aislamiento de EV plasmático e introducción en el análisis proteómico para integrarlo en el flujo de trabajo clínico de un servicio de urgencias. Nuestra próxima investigación se centrará en integrar en nuestra metodología diferentes colectivos de pacientes, entre los que se encuentran pacientes con insuficiencia cardíaca descompensada, arritmias o miocardiopatía por taquicardia, así como estudios longitudinales de pacientes sometidos a cirugía de bypass.

Con este protocolo, nuestro objetivo es identificar nuevos biomarcadores unidos a EV que contribuyan al diagnóstico y pronóstico de las patologías antes mencionadas. Para comenzar, centrifugar el plasma sanguíneo humano, utilizando una ultra centrífuga con un rotor de ángulo fijo sin romperse. Después de que los restos y el cuerpo apoptótico se asienten, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y ultracentrífugo a 100, 000 G durante dos horas a cuatro grados Celsius sin romper para aislar las vesículas extracelulares.

Retire el tubo con cuidado después de la ultracentrifugación. Con una pipeta electrónica, aspire suavemente el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro de plasma empobrecido de vesícula extracelular. Cambie a una pipeta de 1000 microlitros para pipetear cuidadosamente el plasma restante sin alterar la pellets de vesícula extracelular.

Incline gradualmente el tubo durante el pipeteo para asegurarse de que no quede plasma y vuelva a suspender el pellet en PBS. A continuación, diluya la solución madre de vesícula extracelular con PBS helado en diferentes proporciones para lograr un rango de recuento final de 10 a 100 nanopartículas por fotograma durante el seguimiento. Encienda el instrumento NTA e inicie el software correspondiente en el ordenador conectado.

Inserte la cámara en el ataúd láser y haga clic en iniciar cámara para activarla. Extraiga un mililitro de PBS en una jeringa y conéctela al tubo frontal. Enjuague bien el sistema de tubos, asegurándose de que no queden burbujas de aire en la cámara.

Supervise la cámara para detectar burbujas de aire o partículas contaminantes. Ahora extraiga la dilución de trabajo de la vesícula extracelular preparada en una jeringa de un mililitro e inyéctela en la cámara. Vaya a las pestañas de captura y procesamiento para ajustar la ganancia de la pantalla para que coincida con el brillo del monitor.

Modifique el nivel de la cámara para mejorar la diferenciación de nanopartículas en la pantalla. Establezca un umbral de detección adecuado en la pestaña de proceso para diferenciar las partículas del ruido de fondo. Enfoque la cámara usando la rueda de enfoque a cada lado del instrumento hasta que las nanopartículas aparezcan nítidas en la pantalla.

Después de establecer una temperatura constante de 22 grados centígrados para todas las mediciones en la configuración del hardware, haga clic en el botón ejecutar para iniciar la medición. Grabe al menos tres videos de 30 segundos cada uno para cada ejecución de muestra. Haga clic en cambiar para ingresar el factor de dilución de las muestras y, finalmente, haga clic en exportar para guardar los resultados.

Mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas, se identificaron y visualizaron vesículas extracelulares en función del brownie y el movimiento. El análisis reveló una concentración media de partículas de 1,2 por 10 elevado a una potencia de 10 partículas por mililitro en plasma de individuos sanos, lo que demuestra la presencia de vesículas extracelulares. El tamaño promedio de las vesículas extracelulares plasmáticas se midió en 184,7 nanómetros, lo que coincide con las dimensiones típicas de las vesículas extracelulares.