Optimización de los procedimientos de recolección de muestras de biopsia de mama y mastectomía para biobancos, medicina personalizada y aplicaciones de investigación

El objetivo es mejorar la recogida de muestras de cáncer para biobanca, de modo que permita un tratamiento más personalizado mediante secuenciación de ARN de alta calidad y cultivo de organoides a partir de tejidos filipinos de cáncer de mama. Los avances recientes incluyen el uso de organoides derivados del paciente y secuenciación de ARN para predecir la respuesta al tratamiento en el cáncer de mama, especialmente en casos con invasión linfovascular vinculada a la resistencia a fármacos. Utilizamos biopsias guiadas por ecografía, secuenciación de ARN estimación del porcentaje tumoral y cultivos organoides 3D para analizar con precisión los tejidos del cáncer de mama.

Los principales desafíos incluyen la obtención de ARN de alta calidad a partir de muestras pequeñas de biopsia, así como problemas de calidad para la conservación de organoides. Así que, tras comenzar con el cáncer de mama, exploraremos más la expresión génica en una cohorte filipina más amplia y utilizaremos organoides para probar terapias para los siguientes casos: cánceres de tiroides, ovario, páncreas y raros como los tumores filodos. Para empezar, instala una pistola de biopsia con aguja de núcleo calibre 14 bajo la guía de ecografía en una clínica ambulatoria, quirófano u otro entorno aséptico.

Para cada núcleo, recoge una muestra de mama de aproximadamente dos centímetros de longitud desde el centro del tumor y a un centímetro para el tejido normal adyacente. Recoger dos tipos de muestras, tejido normal y tejido tumoral, de cada paciente. Entrega cada muestra al asistente de investigación para que la coloque en una placa de Petri que contenga solución de PBS.

Clasifica las nueve muestras de tejido tumoral en seis núcleos para análisis de ARN y tres núcleos para biobancos. Corta cada núcleo a lo largo o transversalmente usando una hoja estéril. Coloca los tres núcleos de tejido normales en placas de Petri.

Corta los núcleos por la mitad y asignalos para análisis. Distribuye las muestras entre los tubos según la prioridad. Colocar la mitad de los núcleos en frascos criogénicos designados de dos mililitros con 1,25 mililitros de solución estabilizadora de ARN.

Fija las otras mitades en viales de muestra que contienen formol tamponado neutro al 10%. Rellena y presenta los formularios de patología quirúrgica junto con las muestras fijas al departamento de patología. Después de la mastectomía, coloque la muestra en una bolsa limpia tras la documentación y transmítela inmediatamente al Departamento de Laboratorios de Patología sin formalina para reducir el tiempo de frío isquémico.

Obtén un bloque de tejido tumoral mínimo de un centímetro cúbico durante el grosing y córtalo en dos mitades. Trisectar uniformemente el semibloque fresco para secuenciación de ARN, biobanca y cultivo de organoides. Colocar inmediatamente el tejido para la secuenciación de ARN en frascos criogénicos de cinco mililitros, preenfriados y pre-marcados, prellenados con 2,5 mililitros de solución estabilizadora de ARN.

Para la biobanca, utiliza frascos criogénicos de cinco mililitros con la misma solución. Para el cultivo de organoides, utilice viales cónicos de 15 mililitros, prellenados con cinco mililitros de solución de almacenamiento tisular y 0,01 mililitros de primocina. Extrae un tercio de todos los bloques tumorales en un solo tubo cónico.

Obtén al menos un bloque de tejido normal de un centímetro cúbico y córtalo por la mitad para la biobanca de ARN y la histopatología rutinaria. Transfiere el bloque tisular en viales criogénicos de cinco mililitros, preenfriados y premarcados, prellenados con 2,5 mililitros de solución estabilizadora de ARN para secuenciación y biobanco de ARN. Luego sella todos los viales criogénicos con parafilm.

Guarda a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Luego transfiero a menos 20 grados Celsius durante dos a cuatro horas. Y por último, guarda a menos 80 grados Celsius.

Sella las tapas de los viales criogénicos con parafilm. Coloca los viales criogénicos sellados en un estante de tubos de ensayo y cúbrelos con absorbente y plástico de burbujas. Coloca la estantería envuelta en una bolsa recerrable con un registrador de temperatura.

Coloca los paquetes de gel en el fondo de una caja de poliestireno. Luego coloca la bolsa sobre los sobres de gel. Pon otra capa de sobres de gel encima de la bolsa.

Asegúrate de que los tubos estén entre los paquetes de gel para que las muestras se mantengan frías durante el transporte. Mete la caja de poliestireno cerrada en una caja de cartón para envío e incluye el manifiesto en una bolsa Ziploc. Sella y etiqueta la caja para el envío.

Antes de entregar el mensajero, anota el número de viales y la hora de salida del biobanco. Dos muestras con valores y concentración de RIN variables fallaron en el paso de preparación de la biblioteca durante la secuenciación y fueron excluidas en el análisis final. Todas las muestras presentaron excelentes puntuaciones de calidad de secuenciación, donde más del 90% de las llamadas base tuvieron una precisión de al menos el 99,9%. La imagen de campo claro mostró la formación exitosa de organoides a partir de tejidos mastectomizados en estadio tres tras la terapia neoadyuvante, con abundantes estructuras similares a esferoides visibles a baja y alta ampliación.