Name: Microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende a evaluar la función plaquetaria bajo condiciones fisiológicas mediante dispositivos microfluídicos y superficies biológicas. Este método mejora los ensayos actuales y aporta relevancia fisiológica para la medicina transfusional.

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Toda la investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Se obtuvo la aprobación de la Oficina de Protección de la Investigación Humana de la Universidad de Pittsburgh y el consentimiento informado de voluntarios humanos sanos.
1. Preparación del dispositivo microfluídico
<ol>
	<li>Para fabricar la parte PDMS del dispositivo, prepare un molde maestro con latón a través de micromecanizado de control numérico (CNC) por computadora. NOTA: Dependiendo de las dimensiones del canal, se pueden utilizar técnicas de fotolitografía para crear un molde maestro. El dispositivo utilizado en este protocolo incluye ocho canales micromecanizados paralelos de aproximadamente 480 μm de ancho, 140 μm de alto en la entrada y salida del dispositivo, y 40 μm de alto en la estenosis del dispositivo, con una longitud de rampa hacia/desde la región estenótica de aproximadamente 0,3 mm. Las longitudes de los canales son de aproximadamente 6 mm.</li>
	<li>Con un molde maestro obtenido, vierta la base de elastómero de silicona (obtenida del kit de elastómero) en un plato de pesaje. Añadir el Agente de Curado de Silicona (obtenido del kit de elastómeros), que facilita la reticulación de las cadenas de polímeros de silicona para transformar el PDMS líquido en un sólido duradero y flexible, en una proporción de 10:1 (agente base) y agitar bien la mezcla.</li>
	<li>Coloque el molde en una placa de Petri y vierta el PDMS sin curar en el molde. Coloque la placa de Petri dentro de un desecador de vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas.</li>
	<li>Termine de curar el PDMS en el molde maestro colocándolo en un horno a 70 °C durante 90 min.</li>
	<li>Después de completar el curado del PDMS, corte el yeso microfluídico con una cuchilla de afeitar o un bisturí. Perfore agujeros en los bordes de los canales (1,5 mm de diámetro en ambos lados).</li>
	<li>Con cinta de laboratorio, limpie la superficie de un portaobjetos de vidrio y el lado grabado del molde microfluídico. Utilice aire comprimido según sea necesario para eliminar los residuos restantes.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos de vidrio y el molde microfluídico con el lado grabado hacia arriba en un limpiador de plasma. Encienda la bomba de vacío, selle la cámara y encienda el limpiador de plasma a la configuración alta. Deje el portaobjetos y el PDMS en el limpiador de plasma durante 30 s, luego apague el limpiador de plasma y retire la aspiradora.</li>
	<li>Une el molde y el portaobjetos de vidrio limpiados con plasma presionando suavemente los lados que estaban boca arriba en el limpiador de plasma. A continuación, coloque el dispositivo microfluídico en un horno/placa calefactora a 70 °C durante 10 min. NOTA: No aplique demasiada presión al unir la corredera de fundición y vidrio, ya que eso podría provocar una pérdida en la morfología del canal.</li>
	<li>Enjuague cada cámara con 10-30 μL de etanol al 70% para esterilizar y deje que el dispositivo microfluídico se seque en una placa calefactora a 70 °C. NOTA: Los dispositivos deben fabricarse con al menos 24 horas de anticipación, pero pueden fabricarse con semanas o meses de anticipación. Los dispositivos deben almacenarse en un recipiente hermético o en una placa de Petri cubierta a temperatura ambiente.</li>
	<li>El día antes de la experimentación con el dispositivo microfluídico, vuelva a enjuagar cada cámara con 10-30 μL de etanol al 70% para esterilizar y deje que el dispositivo microfluídico se seque en una placa calefactora a 70 °C.</li>
	<li>Cubra la cámara con reactivo de colágeno fibrilar equino tipo 1 (1 mg/mL), diluido en NaCl al 0,9% en una proporción volumétrica de 1:5 a través de una salida designada a la entrada designada. Asegúrese de que se conserva la direccionalidad dentro de un experimento. Guarde el dispositivo en un recipiente cerrado cálido y húmedo para evitar la evaporación del colágeno recubierto dentro del canal.</li>
	<li>Después de 1 hora, enjuague con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la solución de colágeno. Enrasar en la dirección opuesta al recubrimiento. Cuando no esté en uso, guarde el dispositivo nuevamente en un recipiente cálido, húmedo y cerrado.</li>
</ol>
2. Preparación de la muestra de sangre
<ol>
	<li>Obtener una muestra de sangre entera cirada mediante venopunción. Incubar sangre entera cirada con solución bloqueadora del receptor FC (1:600). NOTA: Las muestras de sangre se almacenan a temperatura ambiente antes y durante la experimentación.</li>
	<li>Incubar sangre entera cirada con anticuerpo CD41 conjugado con fluorescencia (usando un fluoróforo de elección) (1:600). Teñir durante 30 minutos sobre un balancín nutante.</li>
	<li>Como control positivo para la inhibición plaquetaria, añadir Ticagrelor, un antagonista del receptor P2Y12 reconstituido en una solución de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina al 30% p/v (HP-β-CD) en PBS. NOTA: Se deben preparar existencias de Ticagrelor de hasta 6,4 mM y se puede realizar una dilución adicional de las existencias de Ticagrelor en una solución de HP-β-CD (30% de HP-β-CD disuelto en PBS) antes de la experimentación (se recomiendan concentraciones de existencias de 1.000x).</li>
	<li>Incubar la muestra cirada con ticagrelor (concentración final de hasta 6,4 μM) durante 30 min para observar la inhibición plaquetaria.</li>
	<li>Si mezcla el producto sanguíneo con la muestra citada, tiña el producto sanguíneo con una solución bloqueadora del receptor FC (1:600) y un anticuerpo CD41 conjugado con fluorescencia (utilizando un fluoróforo separado y distinto a la muestra citrada) (1:600).<ol>
		<li>Mezclar un equivalente volumétrico de las unidades de producto transfundido con la muestra citada. Por ejemplo, para simular 2 unidades de productos plaquetarios transfundidos a una persona con hemorragia (aproximadamente 250 ml por producto en un volumen total de sangre de 5.000 ml), mezcle 100 μl de producto sanguíneo en 1.000 μl de muestra de sangre citrada.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inmediatamente antes de la experimentación, filtre la muestra de sangre a través de un filtro de 40 μm en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.</li>
</ol>
3. Pruebas de función plaquetaria bajo flujo (Método 1)
<ol>
	<li>Encienda el microscopio y el software asociado.</li>
	<li>Ajuste la bomba de jeringa de extracción al nivel de la platina del microscopio. Ajuste la configuración de la bomba de jeringa.<ol>
		<li>Calcule un caudal volumétrico (Q) para un caudal de cortante de pared promedio deseado (γ) de 3.500 s-1 en la región estenótica del canal utilizando las ecuaciones (1) y (2)21. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) Donde A es el área de la sección transversal del canal, P es el perímetro mojado, λ es el factor de forma, b es el lado corto del rectángulo (altura) y a es el lado largo del rectángulo (ancho). NOTA: Se elige el valor de 3.500 s-1 debido al cizallamiento crítico del FVW y se encuentra en el régimen arterial 7,22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio. Pega los bordes del dispositivo microfluídico a la platina para evitar que se muevan. Asegúrese de que el tomacorriente esté orientado hacia la parte posterior del microscopio.</li>
	<li>Conecte un extremo de un tubo de 1/16" de diámetro interno (aproximadamente 30 cm de largo) a un conector de codo y el otro extremo a una jeringa de 10 ml con un conector de 1/16" de diámetro interior.</li>
	<li>Llene la jeringa con PBS estéril y conéctela a la bomba de jeringa.</li>
	<li>Coloque el conector de codo en la toma de corriente del dispositivo.</li>
	<li>Prepare las líneas de entrada de aproximadamente 10 cm de largo con el conector de codo en un extremo y el corte en ángulo en el otro extremo.</li>
	<li>Conecte el conector del codo de entrada a la entrada del dispositivo.</li>
	<li>Coloque la línea de entrada en un tubo de microcentrífuga de residuos en un soporte en ángulo.</li>
	<li>Utilice el objetivo 10x para dimensiones de canal de aproximadamente 500 μm de ancho y concéntrese en los bordes del canal del dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Prepare las líneas con PBS y limpie el canal de cualquier PDMS/residuo avanzando la bomba de jeringa manualmente. Asegúrese de verificar cerca de la entrada y salida del canal.</li>
	<li>Abra la configuración de captura de imágenes guardada o cree un procedimiento de captura de imágenes para imágenes de series temporales capturadas cada 1-2 s con un canal de campo claro y canales fluorescentes correspondientes a los anticuerpos fluorescentes CD41 utilizados en la muestra de sangre.</li>
	<li>Obtenga la muestra de sangre citrada filtrada y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo justo antes del experimento. Coloque la muestra en el soporte de microcentrífuga en ángulo.</li>
	<li>Coloque la línea de entrada en la muestra.</li>
	<li>Comience a grabar la captura de la imagen.</li>
	<li>Lentamente, retire la jeringa para llenar el volumen muerto en el tubo. Una vez que la sangre llegue al canal , presione inmediatamente reproducir en la bomba de jeringa para reanudar el flujo a la velocidad de cizallamiento deseada.</li>
	<li>Ajuste el enfoque si es necesario.</li>
	<li>Realice el experimento hasta que las plaquetas hayan ocluido completamente la región estenótica del dispositivo microfluídico o hasta un punto final experimental (es decir, 10 minutos).</li>
	<li>Asegúrese de que el tubo de entrada esté sumergido en la muestra de sangre durante todo el experimento.</li>
	<li>Una vez finalizado el experimento, detenga la captura de la imagen y detenga la bomba de jeringa. Guarde la captura de imagen.</li>
	<li>Retire el conector del codo de entrada y vacíe el contenido del tubo en un cónico de desechos. Vacíe también el contenido de la jeringa y las líneas de salida en el cónico de desechos.</li>
	<li>Reemplace los conectores de entrada y salida y los tubos según sea necesario para muestras posteriores.</li>
</ol>
4. Pruebas de función plaquetaria bajo flujo con muestras de bajo volumen (menos de 1 mL) (Método 2)
<ol>
	<li>Repita los pasos 1.1 a 1.4 como se indicó anteriormente.</li>
	<li>Perfore una salida de 1,5 mm de diámetro y una entrada de 3 mm de diámetro en los bordes de los canales.</li>
	<li>Repita los pasos 1.6 a 3.6 como se indicó anteriormente.</li>
	<li>Utilice el objetivo 10x para dimensiones de canal de aproximadamente 500 μm de ancho y concéntrese en los bordes del canal del dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Limpie el canal de cualquier PDMS/residuo haciendo avanzar la bomba de jeringa manualmente y absorbiendo el líquido de acceso con una toallita de laboratorio. Retire cualquier residuo con cinta de laboratorio en la parte superior del dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Avance manualmente la bomba para llenar el depósito de entrada de 3 mm con PBS.</li>
	<li>Abra la configuración de captura de imágenes guardada o cree un procedimiento de captura de imágenes para imágenes de series temporales capturadas cada 1-2 s con un canal de campo claro y canales fluorescentes correspondientes a los anticuerpos fluorescentes CD41 utilizados en la muestra de sangre.</li>
	<li>Inicie la extracción en la bomba de jeringa (manualmente o con la velocidad establecida) y una vez que el PBS avance hacia el canal y la línea de llenado en el depósito esté bajando, detenga la extracción en la bomba.</li>
	<li>Retire el exceso de PBS del depósito con una pipeta.</li>
	<li>Inicie la captura de la imagen.</li>
	<li>Pipetear la muestra de sangre en el depósito (aproximadamente 40 μL) e inmediatamente poner en marcha la jeringa de extracción. Asegúrese de que se inicie el flujo. NOTA: Si el motor de la bomba de jeringa para la extracción no se cebó en el paso 4.8, el flujo no comenzará inmediatamente y se debe repetir el experimento.</li>
	<li>Vuelva a llenar el depósito de sangre durante el experimento, asegurándose de que no entren bolsas de aire en el canal.</li>
	<li>Ejecute el experimento hasta que las plaquetas hayan ocluido completamente la región estenótica del dispositivo microfluídico o hasta un punto final experimental (es decir, 10 minutos).</li>
	<li>Una vez finalizado el experimento, detenga la captura de imágenes y detenga la bomba de jeringa. Guarde la captura de imagen.</li>
	<li>Elimine el exceso de sangre en el depósito mediante pipeteo. Vacíe el contenido del tubo de extracción en un tubo cónico de desecho.</li>
	<li>Reemplace los conectores y los tubos según sea necesario para muestras posteriores.</li>
</ol>
5. Descontaminación
<ol>
	<li>Limpie las líneas de entrada y salida de sangre enjuagándolas en una solución de lejía al 10%.</li>
	<li>Si se han utilizado todos los canales del dispositivo microfluídico, deseche el dispositivo en el contenedor de residuos biopeligrosos de Sharps. NOTA: Todos los desechos biológicos deben eliminarse adecuadamente en los desechos de riesgo biológico.</li>
</ol>
6. Análisis de imágenes
<ol>
	<li>Exporte las imágenes de los experimentos cinéticos utilizando software haciendo clic en Archivo | Exportación/Importación | Exportación.</li>
	<li>Seleccione los siguientes parámetros: tipo de archivo: Formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF); compresión: LZW; verifique los datos originales y el píxel de desplazamiento; desmarque Aplicar curva de visualización y color de canal; marque Definir subconjunto (región, región rectangular y seleccione el área del canal con una medición de anchura y altura de conservación entre condiciones). Exporte a la carpeta deseada y marque Crear carpeta.</li>
	<li>Tenga en cuenta los siguientes valores experimentales en el software: cuadro de inicio cuando la sangre ingresa al canal; velocidad de fotogramas (Info, Series temporales).</li>
	<li>Mida la intensidad de fluorescencia media normalizada de cada fotograma en un experimento utilizando el código de Matlab proporcionado como Archivo Suplementario 1, cambiando las siguientes entradas para cada experimento: fotograma inicial/fotograma final en función de la longitud del experimento (asegúrese de que la longitud del experimento se conserve entre condiciones); nombre del experimento/nombre de la carpeta; recorte de los parámetros X, Y, H y W. Ejecute el código una vez para el canal fluorescente de plaquetas del receptor y una vez para el canal fluorescente de plaquetas del producto. Informe de los valores de MFI normalizados (columna 2) y AUC normalizados (normalizados a la trama de inicio). Reste el valor de longitud del experimento del valor de AUC normalizado.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Plataforma para la Evaluación de la Función Plaquetaria en Trauma y Transfusión

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<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver Desecadores de vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Agitador digital de placa calefactora</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutante</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS Scout Báscula de equilibrio</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMABLE)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue edition</td><td>Software</td></tr><tr><td><Fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/16 pulgadas ID - Conectores de codo de púas</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-hidroxipropil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16169</td><td>30% disuelto en solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>Filtros de 40 micras</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>anticuerpo CD41</td><td>de Novus Biologicals</td><td>&nbsp; NB100-2614</td><td>Proporción 1:600 en sangre total</td></tr><tr><td>Reactivo de colágeno Chrono-Par</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>Proporción 1:5 en 0.9%</td></tr><tr><td>Microscopía Electrónica Salina Sciences Miltex Biopsy Punch con Émbolo, 3.0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrífuga Snap-Cap Tubos SafeLock, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox Blanqueador germicida</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>70%</td></tr><tr><td>Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Gas Comprimido Supra</td><td></td><td></td> 1381978 <td></td></tr><tr><td>humano TruStain</td><td>Biolegend 422302</td><td></td><td>proporción 1:600 en sangre total</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatula Espátula de polipropileno desechable</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí de seguridad</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr>solución<td>salina</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Sartorius Poliestireno Barcos de pesaje</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Deslizamiento Deslizante - Superslip No. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td></tr><tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubo transparente de PVC de 1/16" de diámetro interior, 1/8" de diámetro exterior, 50 pies de longitud</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Latón 360 ultramecanizable Barra</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>Para la fabricación de moldes maestros</td></tr><tr><td>Vacutainers</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>World Precision Instrument Punzón de biopsia reutilizable, 1,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Los experimentos microfluídicos posteriores al uso de este método deberían mostrar la formación de trombos ricos en plaquetas en la región de estenosis del canal de flujo (Figura 1). La figura 1A ilustra resultados representativos en los que las plaquetas funcionales formaron un trombo en la región estenótica del canal para bloquear el flujo sanguíneo a través del canal. Las curvas de intensidad media de fluorescencia (MFI) de las imágenes cinéticas tomadas durante la duración del experimento ilustran una fase de retraso, crecimiento y meseta de la incorporación de plaquetas en el trombo en crecimiento (Figura 2A, C). El aumento de las concentraciones de un antagonista de P2Y12, Ticagrelor, disminuye el MFI plaquetario, así como el área calculada bajo la curva (AUC) de las curvas MFI (Figura 2B, D). Se necesitan tiempos de incubación más largos (30 min en comparación con 5 min) para observar una disfunción plaquetaria pronunciada, de acuerdo con una relación dosis-respuesta más pronunciada utilizando agagemetría de impedancia de sangre total después de una incubación de Ticagrelor de 30 min en comparación con la incubación de 5 min (Figura Suplementaria S1). En diferentes condiciones del vehículo, se observaron efectos similares dependientes del tiempo de la inhibición de P2Y12 en el modelo microfluídico (Figura suplementaria S2).
La visualización de dos poblaciones plaquetarias en el método de reanimación hemostática simulada ilustra la incorporación de ambas poblaciones plaquetarias dentro del trombo (Figura 3A). La incorporación de ambas poblaciones de plaquetas en su señal fluorescente correspondiente se puede cuantificar cinéticamente a lo largo de la duración del experimento mediante mediciones de MFI (Figura 3B). Las pendientes más pronunciadas en la fase de crecimiento, así como el aumento de las mediciones de MFI en el punto final, demuestran una mayor funcionalidad plaquetaria y potencial hemostático, lo que se puede ver en la cuantificación de las plaquetas receptoras cuando la muestra de sangre fue inducida con disfunción plaquetaria a través de la inhibición de P2Y12, y luego, la reanimación simulada mezclando sangre entera autóloga fresca en una proporción volumétrica de 1:10 teñida con un fluoróforo plaquetario distinto. Con la mezcla autóloga de sangre entera, se incorporaron más plaquetas del producto transfundido simulado en comparación con un producto plaquetario de aféresis en el día 5 de almacenamiento a temperatura ambiente, que mostró una incorporación mínima del producto en el trombo formador. La mezcla del producto plaquetario a temperatura ambiente del día 5 también mostró una menor incorporación de plaquetas en el receptor en comparación con la mezcla con sangre entera autóloga fresca (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
Figura 1: Representación de las pruebas de función plaquetaria mediante microfluídica. (A) Se muestra una configuración experimental microfluídica esquemática para las pruebas de función plaquetaria utilizando muestras de sangre de bajo volumen, incluida una bomba de jeringa de extracción que extrae sangre a través de una cámara de flujo estenótico, lo que permite la captura de imágenes en tiempo real. (B) Se muestra una vista lateral de una cámara de flujo estenótica, incluida una superficie recubierta de colágeno en la que las plaquetas se adherirán, activarán y agregarán, lo que dará como resultado un trombo creciente en la región estenótica. (C) Captura de imágenes en tiempo real de una muestra de sangre citrada bajo flujo en un canal microfluídico estenótico (3.500 s-1) y un trombo en crecimiento formado durante 300 s. Barras de escala = 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
Figura 2: Reducción de los cambios en el pliegue de la MFI plaquetaria y del área bajo la curva después de 30 min de incubación con el antagonista de P2Y12 Ticagrelor. (A) La incubación con el antagonista P2Y12 durante solo 5 min demuestra fases de retraso ligeramente extendidas de las curvas de MFI y (B) ligeras disminuciones en el AUC de MFI. (C) La incubación durante 30 min con el antagonista P2Y12 da lugar a fases de retraso prolongadas y valores de MFI finales reducidos, así como (D) una disfunción más robusta demostrada a través del AUC de MFI. Los puntos de datos individuales representan réplicas biológicas y se muestran la media ± la desviación estándar. Abreviaturas: MFI = intensidad media de fluorescencia; AUC = área bajo la curva; HP-β-CD = 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
Figura 3: Mezcla de productos sanguíneos con inhibición coagulopática de P2Y12 en la muestra receptora, simulando la disfunción plaquetaria del paciente, en la cámara microfluídica. (A) Unidad plaquetaria de aféresis (plasma, día de almacenamiento 7) (CD41 en cian) mezclada en una proporción de 1:10 con sangre citrato preincubada con 0,8 μM de ticagrelor durante 30 min (CD41 en rojo). (B) Curvas representativas de intensidad de fluorescencia media normalizada de la muestra de sangre del receptor que recibe una unidad de plaquetas por aféresis (día de almacenamiento 5) o sangre entera fresca autóloga (proporción 1:10) junto con la cinética de las plaquetas del receptor a lo largo del tiempo. La sangre citrato del receptor se preincubó con 0,8 μM de ticagrelor durante 30 min antes de mezclarla con productos sanguíneos. (C) Imagen representativa de la pila z de un dispositivo modificado unido a un cubreobjetos para microscopía confocal. El producto plaquetario de la aféresis se mezcló con una muestra de sangre trombocitopénica en una proporción volumétrica de 1:5 (producto:sangre) además de un anticuerpo del factor de von Willebrand (1:600). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Código de Matlab para el análisis de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S1: Agregación de impedancia de sangre total dependiente del tiempo de la inhibición de P2Y12 con Ticagrelor. La incubación durante 30 min da como resultado una relación dosis-respuesta más pronunciada en comparación con 5 min. Las soluciones de vehículos y fármacos se utilizaron al 0,1% v/v. Los puntos de datos individuales representan réplicas biológicas y se muestran la media ± la desviación estándar. Abreviaturas: AUC = área bajo la curva; HP-β-CD = 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Inhibición de P2Y12 dependiente del tiempo con Ticagrelor en un modelo microfluídico de la función plaquetaria. Se muestran las curvas representativas de MFI y los valores del área bajo la curva para las réplicas técnicas de un donante sano individual con un vehículo de etanol (1% v/v) utilizado para la solubilidad del fármaco. Abreviaturas: MFI = intensidad media de fluorescencia; AUC = área bajo la curva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

microfluidics-in-assessing-platelet-function

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

La transfusión y hemostasia de plaquetas se modeló utilizando cámaras de reconstitución de sangre y flujo microfluídico para investigar la función de las plaquetas de los bancos de sangre. Los datos demuestran las consecuencias de la lesión por almacenamiento de plaquetas sobre la hemostasia, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Se describe un método sencillo para el aislamiento de plaquetas lavadas a partir de sangre humana seguido por mediciones de la agregación plaquetaria inducida por agonistas por turbidimetría. Como un ejemplo aplicamos este método para estudiar la respuesta de agregación de plaquetas humanas a colágeno después de un pre-incubación con el inhibidor de canales Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetría en plaquetas humanas lavadas: El efecto de la Pannexin1-inhibidor de azul brillante FCF sobre la agregación inducida por colágeno

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Aquí se presenta un protocolo para un nuevo ensayo funcional plaquetario multiparamétrico dinámico utilizando un biosensor capacitivo. Este enfoque, diseñado dentro de un microambiente semirrígido para mejorar la relevancia fisiológica, proporciona tres parámetros de salida sensibles al recuento de plaquetas, las fuerzas de estimulación y las vías de activación.

Evaluación dinámica multiparamétrica de la función plaquetaria mediante un biosensor capacitivo

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Este trabajo describe un ensayo microfluídico que utiliza el esfuerzo cortante para desencadenar la formación de trombos en sangre y caracteriza el trombo mediante múltiples dimensiones de lectura. El ensayo puede medir la tendencia protrombótica de las muestras de sangre y, por tanto, es útil en el diagnóstico de enfermedades, el descubrimiento de fármacos, así como en estudios mecanicistas básicos relacionados con la trombosis.

Ensayo de Perfilado de Trombo: Una plataforma basada en microfluídica para caracterizar de forma exhaustiva la trombogénesis biomecánica

Un procedimiento no invasivo para evaluar la función endotelial se demuestra con el 2000 Endo-PAT.

Valoración de la función endotelial vasodilatador con el 2000 Endo-PAT

Aprende a evaluar la función plaquetaria bajo condiciones fisiológicas mediante dispositivos microfluídicos y superficies biológicas. Este método mejora los ensayos actuales y aporta relevancia fisiológica para la medicina transfusional.

Microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria

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