Name: Cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende el aislamiento de células gliales entéricas equinas para estudiar su papel en la inflamación intestinal y las complicaciones postoperatorias en caballos. Este protocolo reproducible ayuda a comprender la función de barrera intestinal.

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<meta charset="utf8"></head><body>Estudio de las interacciones entéricas glio-epiteliales en la inflamación relacionada con cólicos

<ol><li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>Morton, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+and+postoperative+factors+influencing+short-term+survival+of+horses+following+small+intestinal+resection%3A+92+cases+%281994-2001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001).</a> Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).</li>
<li>French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+surgical+colic%3A+risk+factors+for+postoperative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications.</a> Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).</li>
<li>Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+the+local+inflammatory+response+in+the+intestinal+mucosa+and+muscularis+of+horses+undergoing+small+intestinal+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection.</a> Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).</li>
<li>Sheats, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+equine+SIRS%2C+sepsis%2C+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils.</a> Front Vet Sci. 6, 69(2019).</li>
<li>Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+and+postoperative+gastrointestinal+tract+dysfunction%3A+pathogenic+mechanisms+and+novel+treatment+strategies+beyond+colorectal+enhanced+recovery+after+surgery+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharm%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols.</a> Front Pharm. 11, 583422(2020).</li>
<li>Stoffels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+involves+interleukin-1+receptor+signaling+in+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia.</a> Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li>
<li>Savidge, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+regulate+intestinal+barrier+function+and+inflammation+via+release+of+S-nitrosoglutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Hellman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+equine+enteroids+and+enteroid-derived+2D+monolayers+that+are+responsive+to+microbial+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics.</a> Vet Res. 52 (1), 108(2021).</li>
<li>Al-Sadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+permeability+is+mediated+by+JNK+pathway+activation+of+claudin-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene.</a> PLoS One. 9 (3), e85345(2014).</li>
<li>Ochoa-Cortes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells%3A+A+new+frontier+in+neurogastroenterology+and+clinical+target+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases.</a> Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).</li>
<li>Ziegler, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cell+network+function+is+required+for+epithelial+barrier+restitution+following+intestinal+ischemic+injury+in+the+early+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).</li>
<li>Grubišić, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia%3A+the+most+alimentary+of+all+glia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tampón HEPES de 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>2 mM GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>25050-061</td><td></td></tr><tr><td>4' 6-Diaminidino-2-Phenylindol</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Alfa músculo liso anticuerpo de actina</td><td>Abcam</td><td>7817</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>AA9529</td><td>4,4 g/mL alícuotas de stock, concentración final 1,1 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Antimicótico 1x</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino</td><td>Sigma</td><td>AA3311</td><td></td></tr><tr><td>BSA 50 mg/mL solución madre</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>ACROS Organiics</td><td>206791000</td><td>Componente de Equine Ringer ' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>Collagenasa</td><td>Sigma</td><td>9891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 medios</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>21207</td><td></td></tr><tr><td>EVOM EndOhm doble electrodo cámara de medición TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVM-EL-03-01</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Manual para la medición de TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>G5</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>solución de gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td>Concentración final 20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>GFAP anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>4674</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>28175</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 y beta; ELISA</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESIL1B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>P330-500</td><td>Componente de Equine Ringer' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-00-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33-500</td><td>Componente de Ringer Equino s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP332-1</td><td>Componente de Equine Ringer' s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td>Componente de Equine Ringer' s Caldo 1: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 2 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP329-500</td><td>Componente de Ringer Equino s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>S637-212</td><td>Componente de Equine Ringer' s Caldo 2: combine con otros ingredientes, luego agregue 100 mL de este caldo a un cilindro graduado y diluya a 1L con agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con 5% de CO2. Combine con Equine Ringer' s Stock 1 para completar " Campanero' s Solución".</td></tr><tr><td>Pluma/Solución estreptocócica</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>0,5 mg/mL en 1x tampón de borato</td></tr><tr><td>Software Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteasa</td><td>Sigma</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td>Solución madre al 7,5%</td></tr></tbody></table>

cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

La microdisección del yeyuno equino a la capa submucosa (Figura 1) con una digestión enzimática y mecánica adicional, podría producir cultivos celulares viables de glía entérica equina. Las células demostraron un pleomorfismo con una dominancia de células fusiformes consistente con la glía entérica de otras especies (Figura 2A). Los cultivos fueron positivos para el marcador glial selectivo, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), con baja contaminación por fibroblastos (alfa SMA, Figura 2B). En algunos casos, la microdisección de las capas submucosas no se controló en un grado suficientemente alto, y los cultivos se contaminaron con altos porcentajes de fibroblastos observados a través de la inmunofluorescencia de la actina del músculo liso marcador de fibroblastos (Figura 3).
A continuación, como ejemplo de la utilidad del cultivo de glía entérica equina, se evaluó el impacto de la glía entérica expuesta a IL-1β sobre la función de la barrera epitelial intestinal. La exposición basolateral a los medios del cultivo de glía entérica submucosa equina expuesto a 10 ng y 25 ng de IL-1β durante 24 h aumentó significativamente la permeabilidad (p = 0,05 y 0,04, respectivamente, media de los medios de control = 0,9, media del grupo glial 10 ng IL-1β = 0,8, intervalo de confianza del 95% = -0,2 a 0,02, media del grupo glial 25 ng IL-1β = 0,8, intervalo de confianza del 95% = -0,1995 a 0,01060, n = 3-4) (Figura 4A). Sin embargo, la exposición de las monocapas epiteliales equinas basolaterales de 10-25 ng a la IL-6 equina, una citocina inflamatoria que se ha demostrado que es producida por la glía entérica expuesta a la IL-1β y que induce un aumento de la permeabilidad de los enterocitos en modelos de roedores12, no aumentó significativamente la permeabilidad de la monocapa de enterocitos equinos (Figura 4B)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig01.jpg"> Figura 1: Aislamiento de la glía entérica del yeyuno equino por microdisección y digestión enzimática y mecánica. (A) El yeyuno se cortó a lo largo del borde antimesentérico y se fijó con el lado de la mucosa hacia arriba. (B) Las vellosidades intestinales se visualizaron por microscopía y se extirparon con un raspado suave hasta que se visualizó la lámina propia tenue. (C) A continuación, se retiró la capa de lámina propia hasta que las fibras musculares lisas fueron apenas visibles a través de la submucosa translúcida. (D) La submucosa se cubrió y se retiró de la capa muscular, haciendo cortes a las marcas fibrosas según fuera necesario. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de disección de 10x (B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes de los cultivos de glía entérica submucosa equina. (A) La morfología estrellada (flechas), fusiforme (punta de flecha abierta) y ganglionar (punta de flecha cerrada) de la glía entérica equina se apreció mediante microscopía de contraste de fase. (B) La pureza de los cultivos se evaluó mediante tinción para GFAP, y para el marcador de fibroblastos, actina de músculo liso Barras de escala = 100 mm (A), 400 mm (B). Abreviaturas: GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes de cultivos de glía entérica submucosa equina no exitosos. La pureza de los cultivos se evaluó mediante tinción para GFAP (rojo) y para el marcador de fibroblastos, actina de músculo liso (verde), demostrando un alto porcentaje de contaminación por fibroblastos. La punta de flecha amarilla denota GFAP y la punta de flecha blanca actina de músculo liso. Barra de escala = 400 mm. Abreviatura: GFAP = proteína ácida fibrilar glial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig04.jpg"> Figura 4: TEER de monocapa epitelial equina después de la exposición a citocinas inflamatorias y productos gliales inflamatorios. (A) La exposición basolateral a medios de cultivo de glía entérica submucosa equina, expuesta a 10 ng y 25 ng de IL-1β durante 24 h, aumentó significativamente la permeabilidad (*p = 0,05 y 0,04, respectivamente, n = 3-4). (B) La exposición aguda de la monocapa de enterocitos equinos a 25 ng basolaterales de IL-1β y 10-25 ng de IL-6 equina no aumentó significativamente la permeabilidad de la monocapa epitelial equina (n = 2-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Reactivos para aislamiento y cultivo. Los siguientes reactivos se utilizaron para formular medios para el aislamiento de la glía entérica equina, el cultivo de la glía entérica y el cultivo de células madre epiteliales intestinales equinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino

Inflammatory postoperative conditions of equine colic (acute abdomen) contribute not only to increased client cost, patient discomfort, and ...

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Se introduce un nuevo método para el mantenimiento de la mucosa intestinal humana en la cultura y el seguimiento de la respuesta a diversos tipos de estímulos durante al menos 24 horas. Con nuestro método, se mantiene la polaridad del tejido, lo que permite una estimulación fisiológica a través de la ruta apical.

Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

Este video muestra un método para aislar células gliales entéricas de la submucosa y la lámina propia del intestino del ratón. Describe los pasos involucrados en la extracción de tejido de la submucosa y la lámina propia, el aislamiento de las células gliales entéricas de ellas y el cultivo de las células en una placa de pocillo recubierta para establecer un cultivo de células gliales entéricas.

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Demostramos un protocolo de cultivo celular para el estudio directo de los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso entérico. Se prepara un cultivo mixto de neurona/glía en cubreobjetos a partir del plexo mientérico de un ratón adulto, lo que proporciona la capacidad de examinar la función individual de las neuronas y la glía mediante electrofisiología, inmunohistoquímica, etc.

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