Extracción y detección de geosmina y 2-metilisoborneol en agua y peces utilizando sondas de extracción por sorción de alta capacidad y GC-MS

[Narrador] En este vídeo demostraremos el proceso de extracción y detección de geosmina y 2-metilisoborneol tanto en muestras de agua como de pescado utilizando sondas de extracción por sorción de alta capacidad y cromatografía de gases-espectrometría de masas, o GC-MS. La geosmina y el 2-metilisoborneol son compuestos orgánicos volátiles de origen microbiano que se encuentran en arroyos, estanques, pozos o incluso sistemas de acuicultura de recirculación. Estos compuestos odorantes pueden conferir olores y sabores desagradables al agua y a los peces que se cultivan en ella, incluso en concentraciones extremadamente bajas. Aquí vemos a un científico recolectando agua de un sistema de acuicultura de recirculación. Las muestras de agua de geosmina y 2-metilisoborneol se recolectan en viales de vidrio marrón clasificados para COV sin dejar aire en el vial. Para ello, sumerja y tape el vial bajo el agua para que no queden burbujas de aire. Comenzamos preparando nuestra calibración y estándares internos. Primero, prepare una solución madre etiquetada como C1 agregando 10 microlitros de geosmina y solución de 2-metilisoborneol a una concentración de 100 microgramos por litro a un matraz aforado de 100 mililitros. Llene el matraz hasta la marca de volumen con metanol de grado LC/MS. Esto da como resultado una solución que contiene cada analito a una concentración de 10 microgramos por litro. A continuación, los estándares de calibración se preparan agregando volúmenes específicos de la solución madre C1 a los matraces aforados de 100 mililitros y llenándolos hasta el volumen con agua desionizada. Es importante preparar nuevos estándares de calibración diariamente, ya que estas soluciones son extremadamente perecederas. Para los estándares internos, cree una solución madre I1 agregando 10 microlitros de 2-isopropil-3-metoxipirazina, también conocida como IPMP, en un matraz volumétrico de un litro lleno de metanol de grado LC / MS, lo que hace una solución madre de 10 miligramos por litro. Luego prepare una segunda solución I2 agregando cien microlitros de la solución madre I1 a un matraz aforado de cien mililitros y llenándolo con agua desionizada para lograr una concentración de 10 microgramos por litro. Comience colocando una muestra de agua de vial de 20 mililitros en la bandeja de muestras. Pesa 2,5 gramos de cloruro de sodio y agrégalo a cada vial de muestra. La adición de sal mejora la transferencia de geosmina y MIB del agua al espacio de cabeza. Agregue cinco mililitros de la muestra de agua a cada vial y enriquezca con 50 microlitros de la solución estándar interna I2. Tape y selle cada vial inmediatamente después de la preparación para minimizar la pérdida de analitos. El siguiente paso es la extracción del analito. Coloque la bandeja de muestras en el soporte de la bandeja del muestreador automático y prepare el método del instrumento con los siguientes ajustes clave: Tiempo de agitación previo al muestreo a los 10 minutos. Parámetros de muestreo: Incubar a 65 grados centígrados durante 30 minutos con una velocidad de agitación de 400 RPM. Asegúrese de que la opción de sonda Wash HiSorb esté habilitada para evitar la contaminación cruzada entre muestras. Desorción de la sonda: Configurar durante 15 minutos a 270 grados centígrados. Configuración de la trampa: Una temperatura de carga de la trampa de 25 grados Celsius y un caudal dividido de ocho mililitros por minuto. Una vez que estos ajustes estén en su lugar, inicie el muestreador automático junto con el método GC-MS para el análisis de muestras de agua. Para el análisis de tejido de pescado, coloque un vial de 20 mililitros por muestra de pescado en la bandeja. Homogeneice el tejido de pescado con un procesador de alimentos y pese un gramo del tejido homogeneizado en cada vial. Agregue cinco mililitros de una solución saturada de cloruro de sodio y aumente cada muestra con 100 microlitros de la solución estándar interna I2. Tape y selle cada vial inmediatamente. El método de extracción de las muestras de peces es similar al del agua, pero con diferencias clave debido a la naturaleza rica en lípidos del tejido de los peces. Estas diferencias incluyen el tiempo de agitación previo al muestreo: Establecer en 20 minutos. Temperatura de incubación del muestreo: 80 grados Celsius durante 30 minutos con una velocidad de agitación de 400 RPM. Asegúrese de que la función de sonda Wash HiSorb esté habilitada. Una vez completados estos pasos, ejecute el muestreador automático junto con el método GC-MS para el análisis de muestras de peces, los mismos parámetros de GC-MS se aplican tanto para los métodos de agua como para los de tejido de peces. El GC está equipado con cinco columnas MS de 30 metros por 0,25 milímetros por 0,25 micras. Se utiliza un helio ultrapuro como gas portador, con un caudal de dos mililitros por minuto. El programa del horno comienza con una temperatura inicial de 60 grados Celsius mantenida durante tres minutos, seguida de una rampa de temperatura de 10 grados Celsius por minuto a 100 grados Celsius, luego 20 grados Celsius por minuto a 190 grados Celsius y 30 grados Celsius por minuto a 280 grados Celsius con un tiempo de espera final de dos minutos. El tiempo total de ejecución es de aproximadamente 16,5 minutos. Para la línea de transferencia entre el GC y el MS, ajuste la temperatura a 280 grados Celsius con la fuente de iones a 250 grados Celsius y el cuádruple a 200 grados Celsius. En el MS para el modo de escaneo, use un rango de relación masa-carga de 50 a 350. Para el monitoreo de iones seleccionados, o SIM, use los siguientes iones para la cuantificación y confirmación: IPMP, relación masa-carga de 152 y 137. MIB, relación masa-carga de 95 a 107. Y geosmina, relación masa-carga de 112 y 55. Por último, revise siempre manualmente las selecciones de picos en su software de cromatografía para evitar errores. Este protocolo describe los pasos para la detección de geosmina y 2-metilisoborneol en muestras de agua y peces utilizando sondas de extracción sortiva de alta capacidad y GC-MS. Al seguir cuidadosamente estas instrucciones, los investigadores pueden garantizar resultados precisos y confiables en el análisis de la presencia de estos compuestos. La Figura Uno muestra el efecto de la temperatura de desorción de la sonda en el arrastre. Se analizó un estándar de laboratorio que contenía geosmina y 2-metilisoborneol a 20 nanogramos por litro a tres temperaturas de desorción de sonda diferentes. El panel A proporciona las áreas de pico medias para geosmina y MIB. Posteriormente, cada sonda se desorbió dos veces más a la misma temperatura inicial para evaluar el arrastre. Los resultados para geosmina y MIB se muestran en los paneles B y C respectivamente. El arrastre se expresa como el área del pico como porcentaje del área del pico inicial. Las barras de error representan la desviación estándar en tres réplicas. Los resultados indican que una temperatura de desorción más alta minimiza el arrastre sin comprometer la sensibilidad. La Figura Dos representa una comparación de la recuperación de datos corregidos versus no corregidos para estándares analíticos a 15 y 40 nanogramos por litro utilizando sondas PDMS para la extracción. Las muestras se corrigieron con el uso de 2-isopropil-3-metoxipirazina, o IPMP, como estándar interno. Sin corrección, la recuperación fue significativamente menor, con correcciones de aproximadamente el 60% de las cantidades de picos conocidas. Una vez corregido, la recuperación fue cercana al 100%, lo que demuestra la importancia de utilizar estándares internos para una cuantificación precisa. La Figura Tres compara los datos de recuperación de geosmina a la izquierda y 2-metilisoborneol a la derecha a 15 nanogramos por litro utilizando dos tipos de sondas: sondas de solo PDMS y de triple fase, que incluyen PDMS, divinilbenceno y carbono de amplio rango. Ambos tipos de sondas muestran un buen rendimiento, aunque las sondas solo con PDMS tuvieron tasas de recuperación ligeramente mejores. Dado este resultado y el ahorro de costos, se realizaron análisis futuros con sondas solo de PDMS. La Figura Cuatro muestra la regresión lineal de las curvas de calibración para geosmina y MIB. El rango sólido representa geosmina con un valor R cuadrado de 0,9999, y la línea discontinua representa MIB, también con un valor R cuadrado de 0,9999. Ambas curvas demuestran una excelente linealidad con un error mínimo, validando la precisión cuantitativa del método en el rango de concentración probado. La Figura Cinco ilustra las concentraciones de geosmina y 2-metilisoborneol en muestras de agua tomadas de siete sistemas de acuicultura diferentes. El panel A muestra las concentraciones de geosmina y el panel B muestra las concentraciones de MIB. Cada sistema tenía al menos tres réplicas y, en la mayoría de los casos, las concentraciones de estos compuestos estaban por encima de los límites de detección del método. Un sistema, etiquetado como sistema uno, excedió el umbral de olor humano para la geosmina, lo que destaca un problema potencial con la calidad del agua en ese sistema. La Figura Seis proporciona datos de dos muestras de peces, etiquetadas como F1 y F2, que fueron enriquecidas con geosmina y 2-metilisoborneol. Ambos compuestos se analizaron por triplicado para determinar la recuperación y la precisión. Se trazan las concentraciones de geosmina y MIB y las muestras de peces con púas, lo que demuestra la capacidad del método para detectar con precisión estos compuestos incluso en tejidos de peces ricos en lípidos. Los métodos descritos hoy proporcionan un marco sólido para la detección sensible de geosmina y 2-metilisoborneol. A través de la integración de sondas de extracción de sorción de alta capacidad y análisis preciso de GC-MS, hemos demostrado una técnica que mejora significativamente nuestras capacidades de detección. Este avance metodológico no solo mejora el rendimiento, sino que también reduce el riesgo de error humano y aumenta la reproducibilidad de los resultados. A medida que sigamos perfeccionando estas técnicas, se convertirán sin duda en herramientas indispensables en el ámbito de la vigilancia ambiental y la evaluación de la calidad de los alimentos.