Activación optogenética de neuronas autonómicas cardíacas intrínsecas en corazones de ratón perfundidos extirpados

Presentamos un valioso enfoque experimental para investigar la cinética de la activación súbita de las neuronas autónomas intrínsecas en corazones perfundidos y la interacción entre la actividad catecolaminérgica y colinérgica cardíaca. Los corazones de ratón perfundidos pueden ser muy sensibles a los cambios en el entorno, como la temperatura, la oxigenación y la concentración de perfusión. Requieren un seguimiento más estrecho que los modelos animales más grandes.

Además, el micro-LED puede requerir un poco de prueba y error al principio para obtener resultados consistentes. Estamos trabajando para entender lo que sucede en el corazón cuando los sistemas simpático y parasimpático se activan al mismo tiempo. Lo nuevo es que estamos estudiando ese tema utilizando la optogenética para fotoestimular los ganglios cardíacos y las neuronas dentro del propio corazón.

El micro-LED que se muestra aquí es de bajo costo y relativamente simple de replicar. Debido a su tamaño, el micro LED es maniobrable y puede apuntar a áreas del corazón con mayor precisión que las fuentes de luz más grandes. Para comenzar, bajo un microscopio de disección en un área bien ventilada, suelde los extremos pelados de dos cables de cobre aislados a los puntos de contacto de un micro-LED de 465 nanómetros.

Conecte el micro-LED a una fuente de alimentación y enciéndalo para probar la soldadura. Corta un centímetro inferior de una punta de pipeta filtrada de 200 microlitros. Empuje el filtro hacia afuera con una varilla de diámetro pequeño.

Inserte el micro-LED con los cables conectados en la punta de la pipeta para que el LED quede al ras con el extremo de la punta. Vuelva a colocar el filtro en la parte superior de la punta de la pipeta para asegurar el LED y los cables. A continuación, pega los bordes del LED a la punta de la pipeta.

Deja que el superpegamento se seque. Para preparar el elastómero de silicona, mezcle la base y el agente de curado hasta que la solución se vuelva uniforme. Retire las burbujas de la mezcla utilizando una cámara de vacío.

A continuación, tome un tubo de centrífuga de 0,5 mililitros y marque los lados para facilitar la extracción del LED. Pega con cinta adhesiva el exterior del tubo de la centrífuga para evitar fugas. Vierta aproximadamente 0,2 mililitros del elastómero de silicona en el tubo.

Coloque la punta de la pipeta micro-LED en el tubo, asegurando al menos un milímetro de espacio entre el LED y la parte inferior del tubo. Coloque el tubo de centrífuga micro-LED en posición vertical en un horno a 50 grados centígrados durante ocho horas o toda la noche. Una vez que el elastómero esté endurecido, retire el LED del tubo.

Una vez curado, recorte el exceso de elastómero de la punta del LED con una navaja multiusos de precisión, sin dejar más de un milímetro. Para comenzar, agregue 175 mililitros de solución Krebs-Henseleit o KH al sistema de perfusión. Coloque un filtro de membrana de 10 micrómetros en el sistema de perfusión de Langendorff.

A continuación, inicie la circulación. Encienda los baños de agua y configúrelos para mantener la temperatura de perfusión a 37 grados centígrados. Para calibrar el caudalímetro, detenga el flujo en el sistema de perfusión mediante una llave de paso.

Luego presione el botón cero en el medidor de flujo para realizar la calibración. Abra el software de adquisición de datos LabChart. Configure el software para incluir 12 canales.

Configure canales para la temperatura del baño cardíaco, la temperatura de la perfusión aórtica, las derivaciones de ECG del uno al tres para derivaciones calculadas adicionales, el cálculo de la frecuencia cardíaca, la tasa de flujo y una salida de generador de funciones para rastrear los pulsos LED. A continuación, utilice el canal designado para la frecuencia cardíaca para calcular la frecuencia cardíaca. Active la función de mediciones cíclicas, configurándola para detectar el ECG del ratón en la derivación uno.

Utilice la extensión de acceso cardíaco de LabChart para calcular las derivaciones tres aVR, aVL y aVF en función de las derivaciones uno y dos. Después de anestesiar y eutanasiar al ratón, sostenga la apófisis xifoides con un par de pinzas y corte la cavidad abdominal con unas tijeras quirúrgicas. Corta con cuidado el diafragma para abrir la cavidad torácica.

Luego corte las costillas para exponer el corazón y los pulmones. Agarre suavemente los pulmones y extirpe el corazón y los pulmones. Coloque el corazón en un plato que contenga una solución de KH heparinizada.

Retira los pulmones y los depósitos grandes de grasa. Bajo un microscopio de disección, ajustado a un aumento de 2x. Transfiera el corazón limpio a un segundo plato de solución de KH heparinizada.

Localice la aorta y deslícela sobre la cánula con pinzas finas. Asegure el corazón a la cánula con una sutura de seda 4-0. A continuación, enjuague la cánula con un bolo de KH heparinizado para eliminar la sangre de los vasos coronarios.

Conecte el corazón canulado al sistema de perfusión y colóquelo en la placa de PDMS llena de perfusión. Coloque los electrodos de aguja de ECG en la placa PDMS de acuerdo con el triángulo de Einthoven. Gire el corazón para que la aurícula izquierda sea accesible.

Use unas tijeras micro de apertura automática para crear una incisión de un milímetro en la aurícula izquierda. Inserte un tubo de un milímetro de diámetro en la incisión para permitir que drene la perfusión atrapada en el ventrículo izquierdo. A continuación, gire el corazón de modo que la aurícula derecha quede hacia arriba y el nódulo sinoauricular sea accesible para la iluminación.

Ajuste los electrodos de ECG según sea necesario acercándolos al corazón para mejorar la relación señal-ruido. Para la activación optogenética, conecte el dispositivo micro-LED a un generador de funciones y configúrelo para producir ondas de pulso con una frecuencia de 10 hercios, un ancho de pulso de 30 milisegundos y una amplitud de 10 voltios de pico a pico. Coloque el micro-LED suavemente en el nodo sinoauricular.

A continuación, encienda el generador de funciones y observe los cambios en la frecuencia cardíaca gracias a la fotoestimulación. Los cambios inmediatos en la frecuencia cardíaca indican una activación efectiva. Apague el generador de funciones.

Permita que la frecuencia cardíaca vuelva a los niveles previos a la activación. Si la activación optogenética da como resultado un cambio en la frecuencia cardíaca de menos de 100 BPM, reposicione el micro-LED para iluminar las neuronas en la aurícula derecha. La estimulación optogenética de las neuronas ChAT redujo la frecuencia cardíaca en más de 100 latidos por minuto durante la estimulación ligera sin que la norepinefrina mantuviera la reducción durante la estimulación.

Con 2.000 nanomoles de norepinefrina, la frecuencia cardíaca disminuyó en 40 latidos por minuto y comenzó a recuperarse antes de que se apagara la luz. La supresión optogenética de la frecuencia cardíaca mediante la fotoestimulación neuronal ChAT fue menos efectiva para superar los aumentos de la frecuencia cardíaca inducidos por dosis altas de norepinefrina, lo que resultó en tiempos de supresión más cortos y disminuciones más pequeñas en la frecuencia cardíaca.