Un modelo murino inmunocompetente para la terapia térmica intersticial con láser del glioblastoma

Nuestra investigación se centra en los tumores cerebrales en adultos. Esto incluye glioblastoma, glioma primario, así como metástasis cerebrales. Hemos desarrollado modelos de ratones con tumores cerebrales para identificar tratamientos más efectivos para pacientes con estas afecciones fatales.

El glioblastoma es el tumor cerebral primario más grave y frecuente. En más del 20% de los pacientes con glioblastoma, este tumor cerebral no se puede extirpar quirúrgicamente. En estos casos, la Terapia Térmica Intersticial con Láser, en resumen, LITT, se utiliza clínicamente para tratar estos tumores cerebrales agresivos.

LITT es una tecnología de ablación térmica de tejidos que se aplica clínicamente para tumores cerebrales inaccesibles quirúrgicamente. Nuestra investigación con modelos de ratón LITT proporcionará información importante sobre las respuestas de los tejidos y las células al tratamiento térmico en el tumor y el tejido cerebral circundante. Una mejor comprensión de los cambios moleculares y celulares causados por la LITT en el cerebro nos permitirá usar la LITT de manera más efectiva para mejorar los resultados de los pacientes con tumores cerebrales.

El desafío experimental más crítico es la precisión de la focalización y el tratamiento del tumor. A diferencia de la cirugía LITT, que se utiliza clínicamente en pacientes humanos, la mayoría de los modelos no tienen imágenes de resonancia magnética en tiempo real, lo que dificulta el objetivo del tumor sin ninguna ayuda visual. Para empezar, registre el peso del ratón anestesiado para calcular la dosis correcta del medicamento.

Afeitar cuidadosamente el área quirúrgica, evitando los ojos, las orejas y los bigotes. Coloque los incisivos del ratón en el orificio de la barra de mordida y ajuste el cono de la nariz de un marco estereotáxico hasta que encaje perfectamente, luego apriete el tornillo de retención para asegurarlo en su lugar. Verifique la profundidad de la anestesia realizando pinzamientos bilaterales de los dedos de las extremidades traseras.

Una vez que el ratón esté correctamente anestesiado, asegure el cráneo con alfileres para los oídos y ajuste la cabeza a una posición de plano de nivel neutro. Aplique el ungüento oftálmico generosamente en ambos ojos para evitar que se seque. Con una jeringa de media pulgada de calibre 28, inyecte meloxicam por vía subcutánea como analgésico.

Reduzca la tasa anestésica para mantener la tasa de respiración objetivo. A continuación, cubra asépticamente al ratón. Con un hisopo de algodón estéril, aplique la solución desinfectante de clorhexidina comenzando por la parte medial y trabajando hacia afuera.

Luego, usando un hisopo de algodón estéril nuevo, aplique etanol al 70% de la misma manera. Vuelva a verificar la profundidad del anestésico monitoreando la frecuencia respiratoria. Luego, con un bisturí de hoja número 15, haga una incisión sagital media de 1,0 a 1,5 centímetros comenzando ligeramente posterior a los ojos en la dirección del cuco.

Ahora, usando un hisopo de algodón estéril, refleje los bordes de la herida para visualizar el cráneo. Frote suavemente cualquier tejido conectivo de la zona. Si es necesario, use un hisopo de algodón estéril empapado en peróxido de hidrógeno para exponer la superficie del cráneo y visualizar las suturas lambda.

Ubique el bregma donde las suturas corneales izquierda y derecha se unen con la sutura sagital. Opcionalmente, para facilitar la reubicación del bregma durante la cirugía de LITT, utilice una resina acrílica de color no tóxica y un palillo de madera estéril y haga una pequeña marca sobre el bregma. Con la jeringa de microlitros en el marco, ponga a cero las coordenadas estereotácticas con la punta tocando bregma.

La coordenada X se refiere al movimiento en el plano lateral medial, la coordenada Y para el movimiento anteroposterior y la coordenada Z para el plano ventral dorsal. Asegúrese de que lambda esté en el mismo plano ventral dorsal que el bregma, donde Z es igual a cero en ambos puntos de referencia. Si es necesario realizar ajustes, asegúrese de que el cráneo aún esté fijado de forma segura aplicando una presión suave con un hisopo estéril.

Coloque la punta de la aguja sobre el área objetivo en las coordenadas más 2,0 milímetros media lateral y más 0,5 milímetros anteroposterior desde bregma. Baje con cuidado la punta de la broca hasta que entre en contacto con el cráneo. Levante ligeramente la punta de la aguja y haga un pequeño punto en el lugar del orificio de la rebaba con un marcador quirúrgico estéril.

A continuación, levante la aguja ligeramente para que no estorbe y perfore un agujero en el lugar marcado, teniendo cuidado de rebabas solo a través del cráneo sin dañar las meninges que se encuentran debajo. Cree un segundo orificio de fresa a más 3,0 milímetros lateral medial y más 0,5 milímetros anteroposterior, o extienda el orificio original a esta coordenada para acomodar el termopar durante el procedimiento LITT. A continuación, retire del hielo el tubo de microcentrífuga que contiene células de glioma de ratón CT2A y agite suavemente el tubo con la yema de un dedo para volver a suspender las células.

Con una jeringa de cinco o 10 microlitros, extraiga suavemente aproximadamente dos microlitros de la suspensión celular. Exprima 0,5 microlitros de la jeringa para eliminar el aire. Limpie el eje de la aguja con un hisopo con alcohol para eliminar cualquier líquido o células residuales.

Baje lentamente la aguja hasta una profundidad en Z igual a menos tres milímetros y haga una pausa de un minuto. A continuación, retraiga lentamente la aguja 0,5 milímetros e inyecte las células a una velocidad de 0,5 microlitros por minuto. Una vez completada la inyección, espere dos minutos antes de retraer lentamente la jeringa durante tres o cuatro minutos.

Hacer una pausa de hasta un minuto después de los primeros intervalos de 100 a 250 micrómetros ayudará a prevenir el desplazamiento de las células. Para cerrar la incisión de la herida, vuelva a aproximar los bordes de la incisión. Usando tres puntos interrumpidos con una sutura de 50, cierre la herida mientras invierte ligeramente los bordes de la herida para asegurarse de que la dermis subyacente se toque.

Aplique la solución de povidona yodada a la herida cerrada y transfiera el ratón a una jaula de recuperación forrada de papel en una almohadilla térmica ajustada a 37 grados centígrados. Una vez que el animal ha recuperado la decúbito esternal, puede ser transferido de nuevo a su jaula de origen. Nueve días después de inyectar la suspensión de células de glioma de ratón CT2A, asegure el ratón anestesiado en el marco estereotáctico.

Recree una incisión en la línea media y use un hisopo de algodón estéril para limpiar el cráneo y eliminar cualquier tejido que oscurezca el bregma. Con el accesorio de terapia térmica intersticial láser o LITT en su lugar en el marco estereotáctico, ponga a cero las coordenadas en bregma para la punta de la fibra láser. A continuación, levante ligeramente la punta de la fibra láser y muévala a las coordenadas lateral medial y posterior anterior deseadas.

A continuación, baje lentamente la sonda hasta la coordenada ventral dorsal objetivo para llegar al objetivo. Configure los parámetros de tratamiento LITT en modo continuo y encienda uno qué. A continuación, cambie el láser de modo de espera a activo y active el láser durante 60 segundos con el pedal.

Si la temperatura sube más de 46 grados centígrados, haga una breve pausa y luego vuelva a activarse, con el objetivo de mantener la temperatura cerca de los 46 grados centígrados. Finalmente, retraiga lentamente el conjunto láser. Limpie suavemente la fibra láser y el termopar con un hisopo con alcohol.

Gire el conjunto para que no estorbe, asegurándose de que las sondas no entren en contacto con el marco. Las imágenes de resonancia magnética cornal ponderadas en T2 mostraron una implantación exitosa del tumor con tasas de toma de casi el 100% y una formación de tumores esféricos consistentes. El tratamiento con LITT dio lugar a ablaciones consistentes con áreas negras hiperintensas definidas, lo que indica necrosis tisular en el núcleo central y un área blanca hiperintensa circundante que muestra edema perioperatorio.