Aislamiento basado en citometría de flujo y evaluación terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales en un modelo murino de cáncer de páncreas

Nos centramos en el desarrollo de un método para aislar y transferir de forma adoptiva linfocitos infiltrantes de tumores, TILs, en un modelo de cáncer de páncreas. Estamos tratando de responder si los subconjuntos de TIL pueden atacar y matar eficazmente los tumores de páncreas in vivo y cómo se pueden optimizar las células T para futuros ensayos clínicos. Desarrollo reciente en terapia celular adoptiva, incluida la mejora de las técnicas de aislamiento y expresión de TIL, la modificación suave de TIL para mejorar su focalización y la combinación de la terapia TIL con otras inmunoterapias como inhibidores de puntos de control o terapias dirigidas para mejorar la eficacia antitumoral.

Hemos establecido un método robusto para aislar y expandir los TILs reactivos al tumor a partir de un modelo de ratón con cáncer de páncreas. Demostramos una mayor eficacia antitumoral de las células T reactivas al tumor transferidas adoptivamente. Nuestro protocolo ofrece un enfoque más específico para la terapia celular adoptiva al permitir el aislamiento y la selección de TIL específicos del tumor en comparación con otros métodos menos específicos.

También se utiliza por imágenes bioluminiscentes para el seguimiento no invasivo de tumores. Nuestros hallazgos avanzarán en el campo al proporcionar un modelo preclínico estandarizado para evaluar la eficacia de la terapia TIL y optimizar los parámetros de tratamiento de los subconjuntos de células T para el cáncer de páncreas. Para preparar una suspensión de células de luciferasa KPC para inducir un tumor pancreático ortotópico en ratones, tripsinícese la línea celular de luciferasa KPC durante un minuto a 37 grados centígrados.

Después de la tripsinización, agregue PBS, transfiera las células y luego centrifugue la suspensión celular. Cuente las células y vuelva a suspenderlas a una concentración de 1 por 10 a la potencia de 6 células por mililitro en PBS que contenga un 30% de matriz de membrana basal. Coloque el ratón anestesiado en una plataforma operativa.

Después de hacer una incisión abdominal izquierda de 0,5 a 1 centímetro, sostenga el bazo con fórceps y exponga el páncreas. Después de preparar las células KPC-luciferasa y la mezcla de la matriz de membrana basal, inyecte 50 microlitros de la suspensión celular que contiene 50.000 células en el páncreas con una aguja de calibre 29. Regrese el páncreas a la cavidad abdominal.

Suturar secuencialmente el peritoneo y la piel. Deje que el mouse se recupere en una almohadilla tibia hasta que esté completamente despierto. Después de siete días, inyecte intraperitonealmente al ratón 60 microlitros de solución de sal de potasio D-Luciferina para imágenes en vivo.

Después de la anestesia, coloque el ratón en el sistema de imágenes in vivo para la detección de bioluminiscencia. Después de la toma de imágenes, retire el ratón del sistema y permita que se recupere naturalmente de la anestesia. Para comenzar, coloque el ratón sacrificado donante en una plataforma operativa.

Esterilizar todo el cuerpo con etanol al 75%. En una capucha estéril, use tijeras y fórceps para abrir la cavidad abdominal. Extirpar el tumor y colocarlo en PBS sobre hielo.

Mida el tamaño del tumor con un calibre Vernier. A continuación, calcule el volumen del tumor utilizando la fórmula que aparece en pantalla. Después de preparar la solución de digestión 1X utilizando colagenasa, dispasa II y ADNasa I en RPMI 1640, agregue uno a dos mililitros de la solución por pocillo en una placa de 12 pocillos.

Pica los tumores en pedazos pequeños con unas tijeras. Transfiera los trozos de tumor a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y digéralos a 37 grados centígrados mientras agita a 70 RPM durante 30 minutos. Para terminar la digestión, agregue uno o dos mililitros de suero bovino fetal al 10% y transfiera la suspensión celular a un tubo de recolección.

Lave los pocillos de una placa de 12 pocillos dos veces con PBS para recolectar las células restantes. Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros, pique y triture los fragmentos de tejido para liberar las células individuales usando el extremo plano de un émbolo de jeringa. Centrifugar el filtrado a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y resuspender el pellet en albúmina sérica bovina al 5% para la tinción con citometría de flujo.

Para empezar, coloque las células aisladas del ratón portador de tumor junto con el bazo o las células mononucleares de sangre periférica del ratón no portador de tumores en una plataforma de trabajo. Tiñir las células con bloqueadores de FC y anticuerpos de flujo en una dilución de 1 a 100. Incuba los tubos en hielo en la oscuridad durante 30 minutos.

Después de la incubación, lavar las células dos veces en PBS por centrifugación antes de volver a suspenderlas en albúmina sérica bovina al 1% en PBS. En un citómetro de flujo, para clasificar las células CD45+CD3+, conecte las células vivas basadas en FSC-A y SSC-A para crear la puerta P1. A continuación, compuerta celdas individuales de P1 basadas en FSC-A y FSC-H para crear la puerta P2. Clasifique las células CD45+CD3+ de P2 mediante la compuerta CD45 y CD3. Recoja las células clasificadas en tubos de recolección.

Centrifugadora clasificó las células CD45 + CD3 + a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender las células en suero de ratón a una concentración de 1 por 10 a una potencia de 6 células por mililitro y colóquelas en hielo. Coloque el ratón receptor inducido por el tumor en una plataforma quirúrgica.

Con una jeringa de insulina de calibre 29 de 1/2 pulgada, inyecte intraperitonealmente las células inmunitarias clasificadas. A continuación, administrar interleucina-2 por vía intraperitoneal durante tres días consecutivos.