Detección rápida y específica de infecciones por Acinetobacter baumannii mediante un sistema de amplificación de polimerasa recombinasa/Cas12A

Mi investigación se centra en las enfermedades respiratorias y las infecciones. Abordaré las tecnologías actuales que avanzan en este campo y las brechas de investigación de todo el campo del proyecto. Las tecnologías clave de las que estamos hablando aquí incluyen secuenciación de próxima generación, CRISPR, secuenciación de ARN unicelular y modelos de análisis de órganos. Tienen una figura dura con respecto a los diagnósticos sobre el trabajo estándar de enfermedades cardíacas y encuentran un mejor tratamiento. Mi protocolo aborda la necesidad de una detección rápida y específica de Acinetobacter baumannii, superando las limitaciones en asuntos de diagnóstico actuales, como las técnicas basadas en cultivos y que requieren mucho tiempo.

[Narrador] Para comenzar, diseñe 12 pares de imprimaciones utilizando herramientas de diseño de imprimaciones basadas en principios de diseño estándar. Obtenga cuatro cebadores directos y tres cebadores inversos para componer 12 pares de cebadores. Evalúe la especificidad y eficacia de cada par de cebadores utilizando la herramienta Primer-BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica. A continuación, diseñe el ARN CRISPR o el ARN guía o el ARNg utilizando la secuencia de andamio de ARN CRISPR LbaCas12a como secuencia fija. Incorpore un segmento específico del objetivo, asegurando que el motivo adyacente del protoespaciador o PAM esté ubicado en el extremo de cinco primos de la hebra no complementaria. Para la construcción del plásmido recombinante positivo, primero amplifique el segmento de ADNr de Acinetobacter baumannii 16S utilizando los conjuntos de cebadores directos e inversos. Prepare la mezcla de reacción de PCR de 50 microlitros como se indica en la pantalla. Establezca las condiciones de ciclo de PCR en la máquina de PCR. Después de purificar el producto de PCR positivo, clonarlo en un vector PUC57 que haya sido digerido con enzimas BamHI y SalI. Diluya el plásmido recombinante positivo en serie en incrementos de diez veces con agua esterilizada de doble destilación. Almacene el plásmido diluido a menos 20 grados Celsius para seguir experimentando. A continuación, mezcle el tampón de rehidratación sin cebador, los cebadores directos e inversos de A. baumannii y el agua doble destilada hasta obtener un volumen final de 465 microlitros. Agite y centrifugue brevemente la mezcla antes de transferirla a los tubos de reacción enzimática del kit RPA. Mezcle bien y agregue 25 microlitros de acetato de magnesio 280 milimolar. A continuación, pipetee un microlitro del plásmido recombinante positivo, que contiene 10⁷ copias por microlitro a la solución A con diferentes pares de cebadores. Incube la solución a 39 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, purifique los productos amplificados con un kit de purificación RPA. Ejecute el producto purificado en un gel de agarosa al 1% a 120 voltios durante 10 minutos para identificar el par de imprimación con la banda más brillante y ancha. Para optimizar el sistema de amplificación de RPA, mantenga constantes las concentraciones de todos los demás componentes de la reacción mientras ajusta el volumen final de la solución A a 465 microlitros. Luego agregue volúmenes apropiados de agua doble destilada sin ARN para obtener las concentraciones finales de cebador como se indica e incubar. Después de purificar y electroforesar el producto RPA, identifique la concentración óptima del cebador y el tiempo de incubación analizando la intensidad y distribución de la banda. Para preparar la solución B, mezcle el reportero de ADN monocatenario, el tampón de reacción CAST12a, el ARN CRISPR CAST12a y el agua bidestilada hasta obtener un volumen final de 15 microlitros. Agregue cinco microlitros de la amplificación de la polimerasa recombinasa o el producto RPA en la solución B. Mezcle bien hasta que esté homogéneo. Coloque las muestras en un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia. Para las pruebas de especificidad, obtenga plantillas de ADN de varias especies utilizando un kit de extracción de ADN de referencia o hirviendo bacterias en agua. Usa el agua como control negativo. Transfiera 10 nanogramos, o un microlitro, de las plantillas de ADN a la solución A que contiene cebadores directos e inversos. Luego pipetea 25 microlitros de acetato de magnesio 280 milimolar. Mezclar bien e incubar a 39 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, agregue cinco microlitros del producto de reacción a la solución B y mezcle. Coloque las muestras en un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia. Configure el canal en FAM y lea la señal fluorescente cada minuto a 39 grados Celsius durante un total de 60 minutos. Para la evaluación de la sensibilidad de la plataforma de detección basada en RPA-CRISPR CAST12a, utilice un plásmido recombinante positivo diluido a concentraciones que oscilan entre una y 10⁷ copias por microlitro como plantilla para la reacción. Usa el agua como control negativo. Transfiera el plásmido a la solución A, agregue acetato de magnesio e incube como se demostró anteriormente. Después de la incubación y la transferencia a la solución B, lea el signo fluorescenteal. El par de cebadores F3-R3 se identificó como el más eficaz para la amplificación de la polimerasa recombinasa, mostrando las bandas más brillantes y densas en la electroforesis en gel de agarosa. Se determinó que la concentración óptima de cebadores para la amplificación era de 0,44 micromolares y el tiempo de reacción óptimo fue de 20 minutos. La intensidad de fluorescencia del ARN1 de CRISPR aumentó con el tiempo, mientras que el ARN2 de CRISPR no lo hizo, lo que llevó a la selección del ARN1 de CRISPR para la detección de A. baumannii. El análisis de especificidad confirmó que el sistema detector de A. baumannii detectó exclusivamente ADN de A. baumannii, sin observancia fluorescencia para otras muestras de ADN bacteriano. El sistema podía detectar tan solo una copia por microlitro de ADN, lo que lo hacía altamente sensible. El ensayo de tiras de flujo lateral confirmó la alta especificidad del método de detección, sin mostrar reactividad cruzada con otras especies bacterianas. El ensayo de A. baumannii detectó con éxito el ADN a través de diluciones desde 10⁷ copias por microlitro hasta una sola copia por microlitro, lo que confirma su robustez bajo luz ultravioleta.