Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca²⁺ a través de la estimulación óptica no genética

La investigación tiene como objetivo avanzar en modelos microfisiológicos cardíacos in vitro mediante la integración de métodos de fotoestimulación basados en materiales. Se centra en superar las limitaciones de la longevidad y la invasividad de la estimulación, proporcionando herramientas fiables para estudiar la fisiología cardíaca, mejorar los procesos de cribado de fármacos y fomentar aplicaciones en el modelado de enfermedades. Los avances recientes en bioestimulación potencian, como para el control celular preciso y no invasivo.

La optogenética permite la modificación genética para regular la actividad celular, mientras que los fototransductores basados en materiales emergentes ofrecen alternativas no genéticas. Esta innovación proporciona un avance significativo en el estudio y la modulación de neuronas, cardiomiocitos y células del músculo esquelético en diversas aplicaciones. Los desafíos experimentales actuales incluyen lograr una entrega constante de luz a los tejidos profundos, optimizar la biocompatibilidad y la estabilidad de los fototransductores y mejorar la precisión de las técnicas de estimulación basadas en la luz.

Además, la integración de estos métodos con sistemas biológicos complejos mientras se mantiene la viabilidad y funcionalidad celular sigue siendo un obstáculo clave. Este protocolo aborda el vacío de investigación de la necesidad de técnicas de estimulación precisa no invasivas en modelos microfisiológicos cardíacos. Mediante el uso de fototransductores basados en materiales, como Ziapin2, este enfoque supera las limitaciones de la estimulación eléctrica y la optogenética tradicionales, ofreciendo un contorno temporal y espacial mejorado al tiempo que preserva la viabilidad y la función del tejido.

Mis hallazgos avanzarán en la investigación al introducir una técnica de estimulación lumínica no invasiva basada en materiales que ofrece una mayor precisión y control sobre la actividad celular en los tejidos cardíacos. Este enfoque elimina la necesidad de modificaciones genéticas, proporcionando una herramienta versátil para modelar la función cardíaca, estudiar los mecanismos de la enfermedad y desarrollar estrategias terapéuticas más efectivas. Para empezar, adhiera dos capas de cinta de laboratorio, una blanca y otra azul, sobre una lámina acrílica transparente, resistente a los arañazos y a los rayos ultravioleta de un milímetro de grosor.

Corte el patrón de viruta en la cinta de acuerdo con el diseño previsto, luego, con un grabador láser de dióxido de carbono, corte la lámina acrílica en círculos. Retire las dos capas de cinta adhesiva dentro de la línea más interna con pinzas. Remoje las virutas en lejía pura durante 30 minutos a una hora para eliminar las líneas gruesas y las manchas oscuras del corte, dejando una línea afilada, y enjuague las virutas en un vaso de precipitados con agua desionizada corriente durante la noche o durante al menos tres horas.

Sonicar las virutas durante 10 minutos en los sellos de polidimetilsiloxano, o PDMS, con características de ranura lineal durante 30 minutos en etanol limpio al 70%. Transfiera las virutas y los sellos a un área limpia debajo de una campana y déjelos secar bajo el flujo de aire durante aproximadamente una o dos horas. A continuación, sonique la gelatina recién preparada durante 15 minutos, luego devuélvala al baño de agua a 65 grados centígrados hasta que esté lista para usar.

Coloque la transglutaminasa microbiana, o tubo MTG, en un desecador con la tapa ligeramente aflojada y encienda lentamente la aspiradora para eliminar las burbujas. Después de la desgasificación, regrese el tubo MTG al baño de agua a 37 grados centígrados. Luego, cubra una hoja de cuadrícula con Parafilm limpio y coloque las fichas en la cuadrícula.

Mantenga el sello PDMS cerca para usarlo. Agregue cinco mililitros de MTG a cinco mililitros de la solución de gelatina, pipeteando con cuidado para evitar burbujas. Ahora, alícuota rápidamente aproximadamente 0,5 mililitros de la mezcla de gelatina en cada chip, asegurándose de que la mezcla cubra el área del chip.

Coloque el sello PDMS con patrón de líneas en la parte superior y aplique un peso de 200 gramos para asegurarse de que la gelatina tenga un patrón paralelo al eje longitudinal del tejido. Una vez que todas las virutas estén moldeadas, cúbralas con un frasco de vidrio para evitar perturbaciones ambientales y permita que se entrecrucen durante la noche. Transfiera el chip y el sello PDMS intercalados a un nuevo plato P150 lleno de PBS para hidratar la gelatina durante 30 minutos a una hora para facilitar la separación del sello PDMS del chip.

Después de eliminar el exceso de gelatina para desmoldar alrededor del chip, transfiera el chip limpio a un nuevo plato P150 lleno de PBS. Almacene los sellos PDMS en etanol al 70%. Para esterilizar las patatas fritas, sumérjalas en etanol durante 10 minutos bajo el capó.

Transfiera las papas fritas a PBS, remójelas durante 10 minutos, seguido de un lavado de PBS tres veces. Para las soluciones de recubrimiento, mezcle 20 microgramos por mililitro de fibronectina con una dilución de uno a 100 de Geltrex en medios de cultivo sin suplemento. Cubra las virutas con esta solución durante dos horas en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Descongele y siembre cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos en medio RPMI que contenga 10 micromolares Y-27632. Reemplace el medio con RPMI desprovisto de Y-27632 después de 24 horas. Tres días después de la siembra de células, use pinzas para quitar con cuidado la cinta blanca de las virutas.

Prepare el aparato de mapeo óptico que consiste en un microscopio de lente en tándem modificado equipado con una cámara de alta velocidad y una lámpara de mercurio de 200 milivatios como fuente de luz de excitación. Coloque un espejo dicroico frente a la cámara de imágenes de calcio designada. Para la estimulación óptica, aplique la estimulación puntual óptica en un extremo del tejido utilizando una fuente de luz LED para estimular Ziapin2, el fototransductor.

Marca el ritmo de los tejidos a una frecuencia de 0,5, o un hercio, a través de una fibra óptica regulada temporalmente colocada a un milímetro de distancia del tejido. Incubar la muestra con dos micromolares X-Rhod-1 añadidos al medio de cultivo durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de lavar las virutas con un medio de cultivo fresco, transfiéralas a un medio RPMI 1640 sin rojo de fenol, suplementado con B-27 menos insulina y HEPES.

Coloque los chips de papel en un plato con temperatura controlada ajustado a la temperatura fisiológica y comience a grabar a una velocidad de fotogramas de 2,5 fotogramas por segundo. La propagación de las ondas de calcio se visualizó con éxito, con una clara resolución espacial y temporal durante la fotoestimulación a frecuencias de 0,5 o un hercio, con velocidades de conducción calculadas en aproximadamente 4,5 centímetros por segundo, consistentes con los valores fisiológicos. Los parámetros transitorios del calcio, incluyendo la amplitud, el tiempo de subida, el decaimiento máximo, la pendiente y el tiempo de decaimiento, fueron cuantitativamente similares entre la estimulación lumínica y la estimulación eléctrica, confirmando respuestas funcionales comparables.