Name: Análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-TC para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T12:55:00.000+00:00
Duration: 3 min 38 s
Description: Aprende a cuantificar regiones ventiladas en modelos de fibrosis pulmonar mediante micro-TC unilateral. Este método computacional mejora la evaluación de intervenciones preclínicas con precisión.

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Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Guangzhou. Los experimentos se llevaron a cabo en ratones machos C57BL/6 de 6-8 semanas de edad y 25-30 g. Los ratones se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luz: 25 lux) con acceso ad libitum a comida y agua y se asignaron aleatoriamente a los grupos de control y BLM.
1. Instilación intratraqueal pulmonar unilateral
<ol>
	<li>Anestesiar ratones machos C57BL/6 (6-8 semanas de edad, 25-30 g) con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg).</li>
	<li>Controle el nivel de anestesia observando la frecuencia respiratoria y el reflejo de retirada de las extremidades.</li>
	<li>Asegure el ratón en posición supina sobre una tabla de plástico con un ángulo de 70°-90°, sujetándolo por los incisivos y las extremidades.</li>
	<li>Use pinzas estériles de punta roma para retraer suavemente la lengua.</li>
	<li>Inserte una aguja roma personalizada de 22 G en la tráquea con un laringoscopio de animales pequeños para visualizar la epiglotis y las estructuras orofaríngeas. Gire la tabla en sentido contrario a las agujas del reloj a -70° para alinear el bronquio principal izquierdo paralelo al bronquio principal. Avance la aguja hasta que sienta resistencia. NOTA: Mida previamente la longitud del catéter utilizando un ratón de práctica de tamaño similar para garantizar una longitud de inserción óptima.</li>
	<li>Gire rápidamente en un ángulo de 30° e infunda 40 μL de solución de bleomicina (0,02 mg). Retire la aguja.</li>
	<li>Mantenga el ratón en posición durante al menos 30 segundos para garantizar la distribución adecuada del fármaco.</li>
	<li>Permita que el ratón se recupere boca abajo sobre una manta térmica.</li>
</ol>
2. Microtomografía computarizada (micro-CT)
NOTA: Los ratones se escanearon con el sistema micro-CT según las instrucciones del fabricante.
<ol>
	<li>Realizar una micro-tomografía computarizada en ratones durante 3 semanas después de la instilación de bleomicina.</li>
	<li>Agregue una cantidad apropiada de isoflurano al vaporizador de la máquina de anestesia de gas para animales pequeños, encienda el vaporizador, ajuste la concentración de inducción al 3% y coloque a los ratones en la caja de inducción hasta que pierdan el reflejo de chancla y muestren una respiración lenta y profunda.</li>
	<li>Retire los ratones de la caja de inducción y colóquelos en decúbito supino en la mesa de exploración para que los ratones tengan las extremidades extendidas y el cuerpo alineado a lo largo de la línea media.</li>
	<li>Ajuste la concentración de mantenimiento de isoflurano en la mesa de exploración al 1%.</li>
	<li>Configure el modo de escaneo Micro-CT: campo de visión transversal de 43 mm, resolución 2K x 2K, tamaño de píxel de 0,042 mm, grosor de corte de 0,042 mm.</li>
	<li>Después de escanear, coloque a los ratones sobre una manta térmica hasta que se despierten.</li>
</ol>
3. Post-procesamiento de micro-TC: segmentación pulmonar selectiva unilateral y análisis de volumen
NOTA: El procesamiento de imágenes y el análisis cuantitativo se realizaron utilizando el software gratuito y de código abierto 3D Slicer (http://www.slicer.org), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aplicaron rangos clínicos de la Unidad de Hounsfield (HU) para la ventana pulmonar para normalizar las imágenes de HU, segmentando el parénquima pulmonar en regiones normo-aireadas ([-1000, -350] HU) como se informó previamente 8,9,11. El procedimiento de procesamiento de imágenes se describe de la siguiente manera:
<ol>
	<li>Abra 3D Slicer. La interfaz operativa se ilustra en la Figura 1.</li>
	<li>Haga clic en Cargar para importar datos de imágenes en formato DICOM. Las imágenes axiales, coronales y sagitales se mostrarán en la interfaz principal (Figura 2).</li>
	<li>Ajuste los parámetros relacionados con la vista sagital como se muestra en la Figura 3 (opcional). (1: mostrar opciones ocultas; 2: elegir Cambiar el nombre del volumen actual; 3: Ingresar Nuevo nombre).</li>
	<li>En el módulo Editor de segmentos , haga clic en Agregar para crear una segmentación para el análisis selectivo de pulmón (pulmón derecho) (Figura 4) (1: Volúmenes; 2: Editor de segmentos; 3: Agregar segmento; 4: Establecer umbral; 5: Ajustar el rango de umbral; 6: Usar para enmascarar; 7: Establecer pincel de esfera).</li>
	<li>Ajuste el rango de umbral a [-1000, -350] HU y habilite la opción Usar para enmascaramiento .</li>
	<li>Utilice la herramienta Pintar con un pincel esférico para segmentar las regiones pulmonares deseadas.</li>
	<li>Seleccione la herramienta Isla y elija Mantener isla seleccionada. Resalte el pulmón derecho, luego haga clic en Mostrar 3D para mostrar el modelo 3D en el panel de visualización (Figura 5) (1: Editar islas (componentes conectados); 2: Elija 'Mantener isla seleccionada'; 3: Mostrar modelo 3D).</li>
	<li>En el panel Terminología , cambie el color del modelo 3D a azul (opcional).</li>
	<li>Repita los pasos 3.4-3.6 para el pulmón izquierdo. Procese las imágenes de la TC axial de tórax capa por capa para calcular el volumen del pulmón izquierdo ventilado y crear un modelo 3D (Figura 6).</li>
	<li>Cambia el color del modelo 3D del pulmón izquierdo a amarillo (opcional).</li>
	<li>Establezca la opacidad de la segmentación del pulmón derecho en 0,2.</li>
	<li>Exporte el modelo 3D según sea necesario (Figura 7).</li>
	<li>Capture capturas de pantalla de la vista 3D o de las imágenes de corte y guárdelas (Figura 8) (1: Captura de pantalla de anotación; 2: Elija el formato de la imagen; 3: Modifique la ruta de guardado).</li>
	<li>Utilice el módulo de estadísticas de segmentos para calcular el volumen pulmonar (mm3) para cada segmento y realizar análisis cuantitativos de las regiones normo-aireadas (Figura 9).</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig01.jpg"> 
Figura 1: La interfaz del software 3D Slicer. La figura muestra la interfaz operativa principal del software 3D Slicer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig02.jpg"> 
Figura 2: Imágenes de TC de fibrosis pulmonar inducida por instilación intratraqueal unilateral en ratones. Vistas axial, coronal y sagital, junto con reconstrucción pulmonar en 3D después de la instilación de bleomicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig03.jpg"> 
Figura 3: Ajuste de los parámetros de la vista sagital. La figura ilustra el ajuste de los parámetros, lo que permite una visualización y un análisis precisos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig04.jpg"> 
Figura 4: Edición de segmentación y ajustes de parámetros. La figura muestra el proceso de edición de la segmentación y los ajustes de parámetros correspondientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig05.jpg"> 
Figura 5: Segmentación 3D del pulmón derecho. El proceso consta de tres pasos secuenciales: editar los componentes conectados para la segmentación pulmonar (paso 1), seleccionar Mantener la isla seleccionada para aislar el pulmón derecho (paso 2) y hacer clic en Mostrar 3D para renderizar el modelo en el panel de visualización (paso 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig06.jpg"> 
Figura 6: Reconstrucción 3D del pulmón izquierdo basada en análisis de micro-TC. Las imágenes de TC axial de tórax se procesaron capa por capa para segmentar las regiones aireadas, cuantificar el volumen ventilado y reconstruir un modelo 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig07.jpg"> 
Figura 7: Reconstrucción pulmonar en 3D basada en análisis micro-CT del volumen pulmonar ventilado en un modelo de fibrosis pulmonar unilateral. Los modelos reconstruidos se exportaron en formatos especificados a directorios predefinidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig08.jpg"> 
Figura 8: Guía para guardar imágenes. La figura describe los pasos secuenciales para guardar imágenes, desde el inicio de la función de guardado a través del menú Captura de pantalla de anotación hasta la selección de formatos y la definición de rutas de almacenamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67837/67837fig09.jpg"> 
Figura 9: Análisis estadístico basado en micro-TC en un modelo de fibrosis pulmonar unilateral. Se analizaron datos cuantitativos derivados de regiones normo-aireadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67837/67837fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Tinción de tricomas de Masson
<ol>
	<li>Fije la muestra de pulmón con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente (RT) durante la noche, deshidrate con una serie de etanol graduada e insértela en parafina. Prepare lonchas con un grosor de 5 μm con un micrótomo rotativo.</li>
	<li>Realice la tinción tricrómica de Masson en las secciones de la siguiente manera.<ol>
		<li>Enjuague las secciones desparafinadas y rehidratadas en agua destilada, seguido de un tratamiento con mordiente en Bouin Fluid precalentado a 56-60 °C durante 1 h o toda la noche a RT.</li>
		<li>Después del lavado, tiña las secciones con la solución de hematoxilina de hierro de Weigert durante 10 minutos, enjuaga con agua corriente tibia del grifo durante 10 minutos y sumérgelas en la solución de fucsina de ácido escarlata de Biebrich durante 10-15 minutos.</li>
		<li>Logre la diferenciación usando una solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 10-15 minutos y controle hasta que las regiones ricas en colágeno pasen de rojo a claro.</li>
		<li>Luego, transfiera directamente los portaobjetos a una solución de azul de anilina durante 5-10 minutos, enjuague con agua destilada y diferencie en una solución de ácido acético al 1% durante 2-5 minutos.</li>
		<li>Después de la deshidratación a través de etanol graduado (95% a alcohol absoluto) y limpieza de xileno, monte las secciones con un medio resinoso.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Análisis de aprendizaje automático de tinción tricrómica de Masson
<ol>
	<li>Evaluar histopatológicamente el análisis de la composición del colágeno en pulmones control y tratados con bleomicina mediante la tinción tricrómica de Masson.</li>
	<li>Para reducir los sesgos dependientes del observador, adquiera imágenes digitales de alta resolución de secciones de pulmón teñidas utilizando un escáner de imágenes de portaobjetos completos.</li>
	<li>Luego, analice cuantitativamente las áreas de colágeno con un software automatizado de análisis de imágenes orbitales 8,9,12. A continuación se describe brevemente el proceso de formación.<ol>
		<li>Delinee manualmente varias anotaciones representativas para cada categoría de tejido (por ejemplo, colágeno, tejido normal y tejido fibrótico). Utilice las características de píxeles extraídas de las regiones de entrenamiento anotadas para construir el conjunto de entrenamiento para la máquina de vectores de soporte (SVM).</li>
		<li>Para las secciones teñidas con Masson, defina la clasificación de los tejidos en tres categorías: colágeno, tejido normal y fondo. NOTA: El modelo de aprendizaje automático se somete a un entrenamiento iterativo en imágenes de portaobjetos completos (WSI) a través de la anotación y el refinamiento repetidos hasta que las evaluaciones validadas por patólogos confirman la categorización precisa del tejido. Una vez que se logra una precisión de clasificación satisfactoria, el proceso se automatiza por completo: las características se extraen de cada píxel dentro de regiones de interés (ROI) válidas y, posteriormente, la SVM predice la categoría de tejido correspondiente con alta precisión.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+longitudinal+and+regional+analysis+of+bleomycininduced+pulmonary+fibrosis+in+mice+by+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">The longitudinal and regional analysis of bleomycininduced pulmonary fibrosis in mice by microcomputed tomography.</a> Heliyon. 9 (5), e15681(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,9% de solución salina</td><td>Hopebio</td><td>HBPP008-100</td><td></td></tr><tr><td>Aguja roma de 22G</td><td>BD</td><td>383922</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora 3D&nbsp; Plataforma de computación de imágenes</td><td>Cortadora 3D&nbsp;</td><td>https://www.slicer.org/</td><td></td></tr><tr><td>Bleomicina</td><td>MCE</td><td>HY-17565</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD</td><td>Referencia R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Kit de manchas Masson</td><td>Sí</td><td>60532ES58</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Pinseng</td><td>Modelos SNC-100</td><td></td></tr><tr><td>Órbita</td><td>Análisis de imágenes de órbita</td><td>https://www.orbit.bio/</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Laringoscopio para animales pequeños</td><td>Instrumentos Yuyan</td><td>CG-02M</td><td></td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM</td><td>Versión 19.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Manta cálida</td><td>Tecnología de animación de laboratorio</td><td>LAT-16-0323</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-tc para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos

Unilateral Lung Volume Analysis Using Micro-CT for Enhanced Assessment of Pulmonary Fibrosis in Preclinical Models

La figura 10A-D muestra los resultados de los cambios en el volumen pulmonar y el análisis de la tinción.
Para evaluar el impacto de la bleomicina (BLM) en el tejido pulmonar, realizamos un análisis comparativo de los volúmenes pulmonares entre los grupos tratados con solución salina (Ctrl) y los grupos tratados con BLM utilizando técnicas de imagen 3D. El volumen del pulmón izquierdo se reduce significativamente en el grupo BLM e...

Análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-TC para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos

Pulmonary fibrosis (PF) is a progressive and irreversible interstitial lung disease characterized by poor prognosis and limited treatment options. The ...

unilateral-lung-volume-analysis-using-micro-ct-for-enhanced

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Aquí presentamos un protocolo para medir de forma sencilla y fiable la curva presión-volumen pulmonar en ratones, demostrando que es lo suficientemente sensible como para detectar cambios fenotípicos en el parénquima en dos patologías pulmonares comunes, la fibrosis pulmonar y el enfisema. Esta métrica proporciona un medio para cuantificar los cambios estructurales del pulmón con la patología en desarrollo.

Medición de la curva de presión-volumen en mouse Pulmones

Describimos un método para la detección del desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones de un modelo de ratón con adenocarcinoma utilizando tomografía microcomputarizada y su uso para monitorear los cambios en el tamaño del nódulo a lo largo del tiempo y en respuesta al tratamiento. La exactitud de la evaluación se confirmó con la cuantificación histológica de punto final.

El uso de la tomografía computarizada-Micro para la evaluación del desarrollo del tumor y Seguimiento de la respuesta al tratamiento en un modelo de ratón de cáncer de pulmón

Describimos a un no-invasivo multimodal enfoque basado en la tomografía molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación longitudinal del modelo ratón pulmonar la fibrosis inducido por la instilación intratraqueal doble de bleomicina la proyección de imagen.

Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones

El objetivo de esta técnica es la visualización ex vivo de redes arteriales pulmonares de ratones postnatales y adultos tempranos a través de la inflación pulmonar y la inyección de un compuesto radioopaco a base de polímeros a través de la arteria pulmonar. También se discuten las posibles aplicaciones para los tejidos fundidos.

Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT

El objetivo de este protocolo es proporcionar una manera eficiente de tiempo para segmentar volúmenes de interés en tomografías computarizadas de alta resolución para utilizarlos en análisis de radioémicas adicionales.

Segmentación por TC pulmonar para identificar consolidaciones y áreas de vidrio molido para la evaluación cuantitativa de la neumonía por SARS-CoV

La TC y la RM 129Xe proporcionan información complementaria sobre la estructura y la función pulmonar que puede aprovecharse para el análisis regional mediante el registro de imágenes. Aquí, proporcionamos un protocolo que se basa en la literatura existente para el registro de imágenes de RM a TC de 129Xe utilizando plataformas de código abierto.

Imágenes pulmonares multimodales: uso de información complementaria de la TC y la resonancia magnética hiperpolarizada de 129Xe para evaluar la estructura y función pulmonar

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B4.

Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

Presentamos un método para analizar una región de interés (ROI) definida por el usuario en un modelo longitudinal de defecto radial in vivo en rata. Este método permite el análisis comparativo entre diferentes andamios previamente limitados por las variaciones en el campo de visión de la tomografía microcomputarizada (μCT), la orientación de la muestra y la presencia basal del andamio.

Análisis de imágenes de tomografía microcomputarizada longitudinal para la región de interés definida por el usuario en defectos óseos de tamaño crítico

El pulmón se perfundieron por tanto la arteria sistémica bronquial y las arterias pulmonares. En la mayoría de las patologías de pulmón, que es más pequeño de la vasculatura sistémica que muestra neovascularización robusto. La cesación del flujo sanguíneo pulmonar promueve la angiogénesis bronquial a paso ligero. Ofrecemos detalles quirúrgicos de la inducción de isquemia arteria pulmonar que promueve la neovascularización bronquial.

La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico

La vasoconstricción pulmonar hipóxica (HPV) es un fenómeno fisiológico importante por el cual en la perfusión alveolar del pulmón de la hipoxia es emparejada a la ventilación. El segmento vascular principal que contribuye al HPV es la arteria intra-acinar. Aquí, describimos nuestro protocolo para el análisis del VPH de vasos pulmonares murinos con diámetros de 20-100 μm.

Análisis Videomorfométrico De La Vasoconstricción Pulmonar Hipóxica De Las Arterias Intrapulmonares Usando Cortes Murinos De Precisión Pulmonar Slices

Aprende a cuantificar regiones ventiladas en modelos de fibrosis pulmonar mediante micro-TC unilateral. Este método computacional mejora la evaluación de intervenciones preclínicas con precisión.

Análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-TC para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos (Video) | JoVE Journal

Análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-TC para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos

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