In vivo Las imágenes revelan el comportamiento migratorio de los leucocitos dentro de las articulaciones

Como las células óseas de la sangre de los leucocitos derivan de la médula ósea, deben entrar en el tejido para causar inflamación. El control de este proceso representa un punto clave en el que se podrían desarrollar nuevas terapias para atenuar la inflamación. En general, el tráfico de leucocitos hacia el tejido inflamado ocurre en las vénulas postcapilares y sigue la cascada de adhesión, que comienza con la captura de leucocitos de flujo libre por la pared del vaso.

A continuación, rodar a lo largo de la pared del recipiente en dirección pro. Detención del endotelio. Así que hay adhesión y arrastrarse en todas direcciones en la superficie del vaso para localizar una ubicación respectiva y migración transendotelial a una ubicación específica dentro del tejido.

Provocando inflamaciones. Estos pasos distintos se regulan mediante la combinación de señales moleculares, incluidos los quimioatrayentes. El quimioatractivo activa los leucocitos a través de ZP Cs y desempeña un papel crítico en la cascada migratoria.

Por tanto, los estudios finales adicionales y los experimentos in vitro no han proporcionado información sobre cómo la señalización del quimioatractor y del receptor quimioatractor regula dinámicamente el comportamiento migratorio de leucocitos in vivo. Así que los avances recientes en tecnología de imagen han proporcionado perspectivas sin precedentes sobre la migración de células inmunitarias en animales vivos, ampliando enormemente nuestra comprensión de la regulación molecular del tráfico celular inmunitario in vivo. Recientemente, hemos solicitado la investigación del mecanismo molecular que controla el tráfico de neutrófilos a los sitios de inflamaciones articulares.

Así que nuestra imagen articular in vivo construye ese nuevo paradigma en las reacciones de hipersensibilidad tipo III dentro de la articulación. Así, nuestro componente del complemento C5a actúa como iniciador de la inflamación, mientras que las células residentes en el tejido juegan un papel más significativo en la inflamación en el paradigma actual de reacciones de hipersensibilidad tipo III. Por tanto, la imagen in vivo de la articulación es una técnica valiosa para descubrir el comportamiento migrado de los leucocitos y la dinámica molecular con la articulación inflamada.

Por eso, compartimos este protocolo para la imagen articular in vivo para apoyar a los grupos de investigación que estudian este proceso en articulaciones inflamadas. Prepara el colágeno bovino tipo II de dilución en ácido acético molar 0,05 agitando durante la noche a cuatro grados para crear la emulsión y mezcla la dilución del colágeno con el adyuvante Freund completo en una proporción 1:2 en una jeringuilla de vidrio. También podía mezclarse a mano durante aproximadamente 20 minutos.

Este proceso genera calor, por lo que enfría la jeringuilla de vidrio que contiene emulsión sobre hielo. Un ratón anestesiado antes de las vacunas. Moldea el pelo a lo largo de la cola usando una máquina de cortar para prepararte para la inmunización.

Inyecta lentamente un volumen de 100 microlitros de la emulsión en el espacio subcutáneo cerca de la base de la cola. La puntuación clínica de la artritis y la medición del grosor de las patas son esenciales para evaluar la actividad de la enfermedad. Normalmente, se realizan la puntuación clínica de artritis y las mediciones del grosor de las patas cada uno a tres días después de las primeras vacunas.

La puntuación clínica de artritis para esta puntuación es la suma de las puntuaciones de las cuatro patas de cada ratón. Las puntuaciones se registran de la siguiente manera. Así que cero es anormal.

Uno es el eritema e hinchazón de un dedo. El segundo es el eritema y la inflamación de dos dedos o eritema e hinchazón de la articulación del tobillo. Tres es eritema e hinchazón de más de tres dedos o hinchazón de dos dedos y articulación del tobillo.

El cuarto es eritema e hinchazón severa del tobillo, pie y dedo con deformidad. Por tanto, la medición del grosor de las patas es medida el grosor de cada pata usando pinzas deslizantes digitales. La medida media del grosor de las patas en las cuatro patas se utiliza para cada ratón.

Los ratones son anestesiados y luego moldean la pata del ratón con una máquina de cortar la pata. Utiliza crema depilatoria para eliminar cualquier vello que quede. Retira la nata con gasas húmedas.

Aplica lubricante corneal estéril en ambos ojos para evitar el resecamiento corneal y reducir el riesgo de oscilación corneal. Bajo un endoscopio quirúrgico, haz una incisión de un centímetro a lo largo de la piel usando microtijeras. Cubre la imagen antes con 1,5% de agarosa y PBS.

El escenario está preparado en el microscopio. Ajusta los ajustes del microscopio confocal, incluyendo la potencia del láser, ganancia, desplazamiento y ubicación. Una vez identificada la ubicación adecuada, comienza la adquisición de imágenes.

Un resultado representativo de la CIA. Normalmente, el inicio de la artritis se observa alrededor del día 28, con la puntuación clínica de artritis y el grosor de las patas alcanzando su máximo en el día 35. La incidencia de CIA en ratones DBA de un día suele superar el 900 al 100% para el día 35.

Aquí, la película de la izquierda muestra el articulación en ratones de control y la de la derecha muestra el articulación en ratones de la CIA. En estas películas, los glóbulos verdes representan neutrófilos positivos para Ly6G. Los lagrados naranjas indican células T CD4 positivas, y las zonas blancas corresponden a vasos sanguíneos.

En el día 35, se puede ver claramente que hay más neutrófilos positivos para Ly6G fuera de los vasos sanguíneos en comparación con las células T CD4+. Estos neutrófilos son altamente móviles, moviéndose activamente en múltiples direcciones dentro de la articulación inflamada. Aquí muestro el análisis representativo de la imagen in vivo de las articulaciones.

El gráfico de la izquierda muestra el número de neutrófilos que se han adherido recientemente, mientras que el de la derecha muestra el número de neutrófilos recién transmigrados durante una grabación de 30 minutos. En las articulaciones artríticas, el número tanto de neutrófilos recién adheridos como transmigrados es significativamente mayor que el observado en las articulaciones de control. En conclusión, presentamos nuestro protocolo actual para la obtención de imágenes in vivo de las articulaciones, que permite la visualización en tiempo real y de alta resolución del comportamiento migratorio de leucocitos en ratones vivos bajo condiciones fisiológicas y patológicas.

Esta técnica nos permite observar directamente cómo interactúan las células inmunitarias dentro de los tejidos inflamados, cómo se adhieren a las paredes de los vasos sanguíneos, transmigran al tejido y orquestan la respuesta inflamatoria. A través de este enfoque, podemos capturar comportamientos celulares dinámicos que de otro modo serían invisibles con métodos histológicos o in vitro convencionales. Al combinar este sistema de imagen con análisis cuantitativo y marcadores moleculares, podemos descubrir vías clave que impulsan el inicio y progresión de la artritis.

Es importante destacar que los conocimientos obtenidos de estas observaciones in vivo no solo profundizan nuestra comprensión de la dinámica de las células inmunitarias, sino que también proporcionan una base científica para identificar nuevos objetivos terapéuticos. A medida que esta tecnología continúa evolucionando, y más investigadores adaptan y perfeccionan la metodología, creemos que la imagen in vivo se convertirá en una plataforma esencial para estudiar enfermedades complejas mediadas por el sistema inmunitario y una brecha poderosa que conecte la inmunología básica con la investigación traslacional y clínica. En última instancia, esperamos que este enfoque contribuya al desarrollo de terapias innovadoras para la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias crónicas en un futuro próximo.