Identificación de especies de micobacterias mediante el método de chip de microarrays de ADN

[Narrador] Esta investigación se centra en el diagnóstico molecular en microbiología clínica. En comparación con los métodos de detección tradicionales, el método de chip de microarrays de ADN para identificar especies de micobacterias es altamente sensible, específico y rápido, lo que puede proporcionar una ayuda importante para el diagnóstico temprano de pacientes clínicos. Actualmente, los métodos de identificación rápida de micobacterias no tuberculosas son limitados en muchos laboratorios de base, lo que afecta directamente el diagnóstico clínico y el tratamiento del paciente. Para comenzar, ajuste la temperatura del baño de agua a temperatura constante a 50 grados centígrados y precaliéntelo. Para preparar chips, agregue 200 microlitros de agua destilada al fondo de la caja de hibridación de chips de microarrays genéticos. Coloque el soporte entre las dos columnas de posicionamiento dentro de la caja. Coloque con cuidado el chip con el lado frontal hacia arriba en el soporte y cúbralo con el cubreobjetos de modo que queden cuatro protuberancias hacia abajo, asegurándose de que el extremo del cubreobjetos se alinee con la etiqueta al final del chip. A continuación, prepare tubos de centrífuga de 200 microlitros, u ocho tiras de pocillos según el número de muestras y etiquételos adecuadamente. Caliente el tampón de hibridación del kit a 50 grados centígrados hasta que se derrita por completo. Después de mezclarlo bien, centrifugarlo rápidamente en una microcentrífuga. Alícuota nueve microlitros de tampón de hibridación en cada tubo o tira preparados. Agregue seis microlitros del producto de PCR correspondiente a cada tubo, haciendo un volumen final de 15 microlitros por mezcla de reacción. Caliente la mezcla de reacción de hibridación a 95 grados Celsius durante cinco minutos para desnaturalizarla usando un instrumento de PCR o un baño de agua. Después del tratamiento de desnaturalización, sumerja inmediatamente la mezcla en una mezcla de agua helada e incube durante tres minutos. Retire la mezcla de reacción de hibridación del baño de hielo y mézclela pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces. Cuando no quede precipitado floculante blanco, agregue 13,5 microlitros de la mezcla de reacción a través del orificio de carga del cubreobjetos. Cubra y selle rápidamente la caja de hibridación y registre el número de chip, la posición de la micromatriz y el número de muestra. Ahora, coloque las cajas de hibridación selladas horizontalmente en el baño de agua a temperatura constante que se ha precalentado a 50 grados centígrados. Después de colocar todas las cajas dentro, inicie el temporizador durante 120 minutos. Una vez completada la reacción de hibridación, saque las cajas de hibridación horizontalmente, desmóntelas y recupere los chips. Coloque inmediatamente las virutas en la rejilla de portaobjetos dentro de un recipiente lleno de solución de lavado de virutas I que se haya equilibrado a temperatura ambiente y lávelas a 80 a 100 RPM en un agitador de temperatura constante durante tres minutos a temperatura ambiente. Lave las virutas nuevamente con la solución de lavado de virutas II en el agitador a 80 a 100 RPM durante tres minutos a temperatura ambiente. Ahora, coloca las patatas fritas en una centrífuga y centrifuga a 100 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Encienda el escáner. Y luego abra el software correspondiente. Haga clic en el botón Control láser para permitir que se precaliente durante 10 minutos. Ingrese información relacionada con la muestra en el software. Una vez que el escáner termine de precalentarse, haga clic en el botón Expulsar. Coloque la viruta seca de manera constante sobre la pequeña pieza de soporte. Empuje el chip suave y horizontalmente en el compartimiento del escáner y haga clic en el botón Cargar. Ahora, ingrese el número de chip en el software y haga clic para seleccionar el área de detección microarray 1 a 4. Haga clic en Seleccionar muestra para elegir las muestras correspondientes para cada micromatriz. A continuación, haga clic en Iniciar detección para comenzar el escaneo de chips. Los resultados del escaneo se mostrarán en la pantalla y se guardarán automáticamente. Utilice la página de consulta de datos para realizar consultas de datos y operaciones de impresión. Después de completar todas las operaciones, apague el láser, salga del software y, finalmente, apague el escáner. La validez de los resultados experimentales se confirma mediante un control de calidad, con el control positivo que arroja un resultado de detección del complejo mycobacterium tuberculosis y el control negativo que no produce mycobacterium. La interpretación de las muestras de prueba comienza con los casos en que todas las sondas, incluida la que tiene el valor de señal más alto, son negativas, lo que da como resultado un informe de no mycobacterium. En muestras donde solo la sonda del complejo mycobacterium tuberculosis muestra una señal fuerte, el resultado se identifica como positivo para ese grupo de especies. Si la sonda correspondiente a mycobacterium avium es la única con una señal fuerte, la muestra se identifica como positiva para mycobacterium avium. Si solo la sonda de control interno es positiva y todas las demás son negativas, el resultado se notifica como indeterminado, lo que indica la presencia de una especie de micobacteria no cubierta por el kit de detección.