Establecimiento de modelos in vitro del cultivo de ganglios de la raíz dorsal: enfoques complementarios para investigar la diafonía entre el cáncer y los nervios

Nuestra investigación se centra en la diafonía entre el cáncer y los nervios, utilizando ganglios de la raíz dorsal en 3D o explantes de DRG y cultivos disociados en 2D para cuantificar la migración tumoral neuroguiada y probar estrategias moleculares para limitar su interacción. Con este protocolo, hemos establecido cultivos DRG complementarios en 3D y 2D, optimizado el crecimiento de neuritas y demostrado un aumento en la invasión de células cancerosas a lo largo de las extensiones de neuritas. Abordamos la falta de modelos reproducibles que capturen tanto las intrincadas interacciones a nivel celular como la arquitectura nerviosa intacta mediante la creación de cultivos DRG complementarios en 2D y 3D a partir de un solo ratón.

Nuestro protocolo produce explantes 3D emparejados y cultivos de neuronas 2D de un solo ratón, preservando la textura angular, permitiendo imágenes de alto contenido, reduciendo el uso de animales y permitiéndonos obtener datos a nivel de tejido y unicelulares en un experimento. Nuestro modelo abrió preguntas sobre qué factores creados por DRG impulsan la invasión, cómo la actividad neuronal, la edad y el genotipo le dan forma, y si dirigirse a los receptores de factores neurotróficos podría disminuir la propagación del cáncer guiada por neuritas. Para comenzar, coloque un ratón sacrificado sobre su abdomen.

Afeite el pelaje, centrándose en el área sobre la columna vertebral para exponer la superficie dorsal. Rocíe etanol al 70% sobre la espalda del animal. Con toallas de papel, limpie desde la cola hasta el cráneo para eliminar el pelaje suelto y evitar la contaminación durante la disección.

Con un par de tijeras esterilizadas, haga una incisión recta a lo largo de la línea media dorsal desde la cola hasta el cráneo. Con unas pinzas romas, retraiga la piel a ambos lados de la incisión para exponer la columna vertebral. Ahora, use un par de tijeras y fórceps nuevos para evitar la contaminación y haga una incisión horizontal en el extremo de la cola de la columna vertebral.

Luego haga dos incisiones longitudinales paralelas a cada lado de la columna vertebral para liberarla. Use fórceps para levantar suavemente la columna vertebral y eliminar el tejido conectivo circundante. Para liberar completamente la columna vertebral, haga una incisión en la parte superior de la columna vertebral cerca del cráneo.

Transfiera la columna vertebral a una placa de 10 centímetros previamente enfriada que contenga HBSS con penicilina estreptomicina mantenida en hielo. A continuación, use unas tijeras de resorte para eliminar cualquier resto de tejido conectivo de la columna vertebral y exponer las vértebras. Transfiera la columna vertebral recortada a una platina de microscopio.

Divida con cuidado la columna a lo largo del plano sagital con unas tijeras de resorte. Con fórceps de punta fina, retire la médula espinal de la columna para revelar los ganglios de la raíz dorsal a lo largo de las raíces de los nervios espinales. Corta los nervios espinales con unas tijeras de resorte.

Luego, retire cualquier tejido conectivo circundante de los ganglios de la raíz dorsal. Con pinzas de punta fina, extraiga suavemente los ganglios de la raíz dorsal de las raíces dorsales. Para el cultivo de montaje completo, coloque los DRG en una placa de tres centímetros que contenga HBSS con penicilina estreptomicina mantenida en hielo.

Utilice puntas de pipeta preenfriadas para dispensar dos microlitros de Matrigel refrigerado en cada pocillo de un portaobjetos con fondo de vidrio de ocho pocillos colocado dentro de una placa de 10 centímetros sobre hielo. Para evitar la polimerización prematura, pipetee solo una gota a la vez. Luego, use fórceps de punta fina para colocar un ganglio de la raíz dorsal en una placa seca.

Agite suavemente para eliminar el exceso de HBSS. Luego transfiera el ganglio de la raíz dorsal limpio a la gota de Matrigel. Después de transferir todos los ganglios a las gotas, incube el portaobjetos con fondo de vidrio en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius durante cinco minutos para permitir que el Matrigel polimerice.

A continuación, agregue cuidadosamente 200 microlitros de medios de cultivo suplementados tibios a cada pocillo. Incube el portaobjetos a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. Utilice microscopía de campo claro para controlar diariamente los ganglios de la raíz dorsal para detectar el crecimiento y la viabilidad neuronal.

Centrifugar un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ganglios de la raíz dorsal agrupados a 200G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de pipetear el HBSS, enjuague los ganglios con medios suplementados precalentados y golpee suavemente. Luego centrifuga el tubo durante cinco minutos a 200G para peletizar los DRG.

Reemplace el medio con un mililitro de solución de papaína. Mezclar suavemente e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos durante 20 minutos, agitando suavemente cada cinco minutos. Luego, agregue 10 mililitros de medios suplementados para neutralizar la papaína y mezcle suavemente.

Centrifugar durante cinco minutos a 400G para peletizar los ganglios de la raíz dorsal. Después de pipetear el sobrenadante, agregue un mililitro de colagenasa tipo IV en la solución de Dispasa II e incube nuevamente. Agregue 4,5 mililitros de medios suplementados para neutralizar la solución enzimática, mezcle suavemente y centrifuge.

Después de pipetear el sobrenadante, agregue cinco mililitros de medios suplementados. Luego agregue Dnasa I para alcanzar una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro. Los ganglios de la raíz dorsal ahora deberían aparecer como un grupo suelto, lo que indica una digestión completa.

Para la disociación mecánica, use una punta de pipeta con filtro de 1.000 microlitros para triturar la solución de los ganglios pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces. Cambie a una punta de pipeta de 200 microlitros y repita la trituración pipeteando cuatro o cinco veces. Filtre la suspensión turbia resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego, enjuague gradualmente el colador con 10 mililitros de medios para asegurar la transferencia completa de las células. Centrifugar la suspensión celular filtrada durante cinco minutos a 1, 000G para granular las células. Retire el medio del gránulo y vuelva a suspender el gránulo celular en 500 microlitros de medio suplementado.

Retire cualquier PBS residual de los pocillos del portaobjetos con fondo de vidrio de ocho pocillos. Distribuya la suspensión de ganglios de la raíz dorsal disociada en los pocillos recubiertos de colágeno e incube. Utilice la microscopía de campo claro para controlar diariamente las células derivadas de los ganglios de la raíz dorsal, evaluando la viabilidad celular y el crecimiento neuronal. Para cocultivar los ganglios de ratón completos con células cancerosas, primero aspire el medio de los cultivos DRG de montaje completo en el portaobjetos con fondo de vidrio de ocho pocillos.

Con una pipeta, agregue suavemente 200 microlitros de la suspensión de células cancerosas al pocillo que contiene la gota de Matrigel y los ganglios de la raíz dorsal. Incube el portaobjetos de cocultivo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. Refresque el medio diariamente lavándolo una vez con 200 microlitros de medio suplementado caliente y agregue 300 microlitros de medio fresco.

Para el cocultivo de ganglios disociados y células cancerosas, aspire el medio de los cultivos DRG disociados en el portaobjetos con fondo de vidrio de ocho pocillos. Luego, distribuya suavemente 200 microlitros de la suspensión de células cancerosas en cada pocillo antes de la incubación. El establecimiento de GRD fue menos eficiente en ausencia de suplementos y la extensión de neuritas se redujo notablemente.

Los DRG de montaje completo de animales más viejos produjeron una extensión de neuritas menos profusa y más distinguible y células gliales mínimas, lo que facilitó la visualización de las interacciones de las células cancerosas nerviosas. La disociación de las neuronas DRG mediante dos pasos enzimáticos dio como resultado una mayor recuperación de las neuronas. Dentro de las 24 horas posteriores al cultivo, las células no neuronales, como las células de Schwan, los macrófagos y los fibroblastos, se hicieron evidentes, mientras que las neuritas que brotaban de las células derivadas de DRG se observaron y aumentaron aún más después de 72 horas.

Las células cancerosas sembradas en insertos transwell recubiertos de Matrigel invadieron las células HEC293, pero no las neuronas DRG después de 24 horas de incubación. Los cultivos de DRG de montaje completo sumergidos en una gota de Matrigel permitieron la extensión de la neurita hacia afuera a través de la matriz hacia la periferia. Con un posicionamiento cuidadoso del DRG en el centro de la gota, proporcionando la máxima extensión de neuritas sin que los bordes crezcan demasiado.

Las células cancerosas se asentaron después de 12 horas de cocultivo alrededor del borde de la gota de Matrigel que contiene el DRG. Después de 72 horas de cocultivo, las células cancerosas habían invadido el Matrigel y se habían movido hacia el ganglio, con interacción directa entre las extensiones de células ganglionares de la raíz dorsal y las células cancerosas observadas. El cocultivo de células derivadas de DRG disociadas con células cancerosas permitió una visualización detallada de las interacciones celulares individuales.