Tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido en virología: imágenes 3D de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación

La infección viral podría causar alteraciones significativas en la infraestructura celular. Para visualizar estos cambios en tres dimensiones, empleamos tomografía STEM para la imagen de células infectadas por virus. La tomografía STEM es laboriosa y lleva mucho tiempo.

Esto hace que la preparación óptima de muestras sea esencial para muestras biológicas, como los conjuntos infectados por virus. La tomografía STEM convencional está limitada a enfermedades de muestra de aproximadamente 200 nanómetros. Nuestro protocolo permite la obtención de imágenes 3D de secciones más gruesas.

Esto permite una visualización más completa de las células infectadas por virus y de las alteraciones ultra estructurales. Muchos virus oncolíticos ya son originalmente ensayos clínicos, por lo tanto, investigadores y desarrolladores de todo el mundo trabajando juntos, y la ciencia está ampliando los límites del tratamiento del cáncer, y los métodos de última generación, como la microscopía electrónica y la tomografía STEM, contribuyen con nuevos conocimientos. Seguiremos respondiendo a preguntas virológicas utilizando la tomografía STEM y combinándola con nuevos protocolos de preparación y otras técnicas de microscopía.

Para empezar, llena la caja LN con nitrógeno líquido en preparación para manipular y transferir los discos de zafiro congelados desde el soporte de congelación a alta presión o HPF a las cápsulas de almacenamiento. Mantén un dewar lleno de nitrógeno líquido cerca para rellenar la caja LN según sea necesario durante el proceso de congelación. Ten un par de pinzas aislantes a mano.

Prepara los recipientes de muestras que contendrán los discos de zafiro después de la HPF. Asegúrate de que tengan una tapa y varios agujeros para que el nitrógeno líquido se vierta y pequeños pesos para que no floten. Coloca el recipiente de etiquetas en la caja LN para que se enfríe antes de usarlo.

Luego, coloca las muestras en la incubadora. Inspecciona los discos de zafiro bajo un microscopio óptico invertido para asegurarte de que hay suficientes células y buena calidad celular antes de comenzar la congelación a alta presión. Para realizar la HPF, toma un disco de zafiro del plato de cultivo y ponlo rápidamente en papel filtro para eliminar el exceso de medio.

Coloca el disco en el soporte HPF con el lado recubierto de carbono hacia arriba, asegurando que el número dos sea legible. Sumerge un separador dorado en hexadecano y colócalo suavemente sobre el disco de zafiro. Coloca un segundo disco de zafiro encima del separador con el lado recubierto de carbono hacia abajo para formar una configuración en sándwich con las celdas apuntando una hacia la otra, asegurándote de que no haya aire atrapado.

Cierra el soporte HPF con cuidado y rapidez para reducir la tensión sobre la muestra. Introduce el soporte HPF en el congelador de alta presión. Bloquéalo según las instrucciones del fabricante e inicia el proceso de congelación.

A continuación, transfiere el soporte HPF a la caja LN. Luego transfiere la punta que lleva los discos de zafiro a la caja LN pre-refrigerada. Extrae cuidadosamente los discos del soporte.

Coloque los viales criogénicos cerrados llenos de solución de sustitución libre en un dispositivo de sustitución libre preenfriado a menos 90 grados Celsius. Espera hasta que la solución alcance la misma temperatura. Preenfría pinzas, un bisturí y unas pinzas grandes sumergiéndolas en nitrógeno líquido para transferir los discos de zafiro.

Transfiere las muestras congeladas a alta presión al dispositivo de sustitución libre. Separa los discos de zafiro uno a uno, manteniéndolos en nitrógeno líquido. Y transfiere rápidamente cada disco individualmente a un vial criogénico con solución de sustitución libre, asegurando que el disco quede completamente sumergido.

Después de cerrar el vial criogénico, colócalo inmediatamente de nuevo en el dispositivo de sustitución libre. Una vez colocadas todas las muestras, comienza el proceso de sustitución. En cuanto las muestras alcancen los 20 grados Celsius.

Continúa lavando las muestras tres veces durante 30 minutos cada una con acetona al 100%. Para preincrustar las muestras, incuba las muestras en un tercio de resina epoxi y dos tercios de acetona durante una hora. Tras incubar las muestras con dos tercios de resina epoxi y un tercio de acetona durante una hora, intercambiar la solución por resina epoxi al 100% e incubar durante la noche con la tapa del vial abierta para permitir que la acetona restante se evapore al día siguiente, transfiere los discos de zafiro a nuevos tubos de reacción marcados llenos de resina epoxi recién preparada.

Coloca los discos horizontalmente apoyados por la pared del tubo, asegurándote de que el lado con las celdas esté orientado hacia arriba. Luego coloca los tubos de reacción con las tapas abiertas en un horno a 60 grados Celsius y deja que la resina se polimerice durante al menos 48 horas. Después de que la resina epoxi se haya polimerizado, sumerge la punta de un tubo de reacción cerrado en nitrógeno líquido durante aproximadamente 10 segundos.

Golpea el tubo de reacción sobre una mesa para liberar el bloque de resina. El disco de zafiro se separa fácilmente de la capa de carbono, que permanece unida a las células incrustadas. Selecciona la región de interés en la muestra incrustada y reduce el tamaño de la muestra a la región de interés.

Utilizando un ultramicrotono con un cuchillo de diamante, recoge secciones de alrededor de un micrómetro de grosor sobre una rejilla de barras paralelas cargadas con gloto tratada con poli-L-lisina para la imagen y tomografía STEM. Trata secciones con oro coloidal como marcadores fiduciarios y aplica un recubrimiento de carbono. Tras cortar e inspeccionar secciones ultrafinas, las muestras están listas para la imagen.

Según la pregunta de investigación, inserta el detector de campo brillante, el detector de campo oscuro, o ambos. Activa el modo de escaneo y adquiere una imagen de prueba de la muestra. Selecciona una ampliación superior a 800.000 veces, que sea mayor que la ampliación final deseada.

Cerca de la región de interés, ajusta el enfoque y corrige el astigmatismo evitando la exposición directa al haz en las áreas críticas de la muestra. Ajusta la altura excéntrica de modo que la región de interés, o ROI, se mantenga centrada a lo largo del rango de inclinación. Elige una característica cercana al ROI, colócala en el centro, enfoca, corrige el astigmatismo e inclina el escenario paso a paso a menos 72 grados.

Para elegir el campo de visión, vuelve al ROI, ponlo en foco y captura una imagen general. Ajusta la ampliación final deseada para la adquisición en serie de inclinación. Configura la adquisición automática en serie por inclinación de las imágenes, que va desde menos 72 grados hasta más 72 grados y la imagen cada 1,5 grados.

Inicia la adquisición automática de la serie de inclinación. Cortes virtuales representativos del termograma STEM ilustraron cómo la orientación de los viriones afecta a la visibilidad de la forma característica de la bala en vistas bidimensionales. Solo los viriones alineados paralelos al plano de visión aparecían con la morfología completa de la bala, mientras que otros parecían circulares o alargados, dependiendo de su ángulo de inclinación.

Para superar las limitaciones de orientación de la imagen 2D, se utilizó tomografía STEM para capturar grandes grupos de virion viral de la estomatitis vesicular recombinante en formación de gemmas, lo que permitió evaluar la forma del virón en tres dimensiones sin sesgo direccional. La vista lateral del termograma confirmó la ventaja volumétrica de la tomografía STEM al capturar muchos viriones completos dentro de una sola sección de 600 nanómetros de grosor, en contraste con el muestreo limitado posible con una sección TEM de 200 nanómetros.