Fabricación de una matriz cerebral expansible personalizable a través de las etapas de desarrollo

Fabricación de una matriz cerebral expandible personalizable a través de etapas de desarrollo, por Chapman y colegas de la Universidad de Kentucky en Lexington, Kentucky. El desarrollo del cerebro de lechón es muy similar al del cerebro humano en varios aspectos. En comparación con ratas y ratones, la proporción del peso cerebral de los cerdones desde el nacimiento hasta la madurez es mucho más cercana a la de los humanos, y las regiones funcionales de los cerebros gyri y cefálicos humanos y de los lechones son muy similares.

Por estas razones, el uso de cerdos y otros grandes mamíferos en la investigación en neurociencia está aumentando. Sin embargo, las matrices cerebrales comerciales para mamíferos de mayor tamaño son costosas, y las opciones suelen limitarse a un solo tamaño o plano de sección. En consecuencia, las matrices comerciales pueden no adaptarse bien a diferentes cepas, tanto masculinas como femeninas, y edades distintas.

Esto es especialmente problemático para los estudios de neurociencia del desarrollo, en los que el tamaño cerebral cambia notablemente con el crecimiento posnatal. Por ejemplo, los cerebros de lechones crecen rápidamente durante los primeros tres meses, aumentando su volumen más de tres veces. La matriz cerebral comercial de lechones está diseñada para adaptarse a cerebros de lechones solo hasta dos semanas de edad.

Aquí presentamos un método personalizable de construcción matricial basado en placa acrílica como una solución rentable y fácil de implementar a este problema. Se obtuvieron cuatro cerdos ingenuos de cuatro días para este experimento. Uno se utilizó para la extracción cerebral a los cinco días de edad, dos a los 32 días y uno a los 38 días.

Tras la extracción del cerebro del cráneo, el cerebro se fijó por inmersión en formalina amortiguada al 10% durante dos días y se colocó en una solución de sacarosa al 30% durante cinco días para criopreservación. A continuación presentaremos cómo hacer un molde del cerebro usando gel de agarosa. El primer paso para crear la matriz es hacer un molde del cerebro.

Ilustraremos el proceso para crear un molde de un cerebro de cerdito postnatal al quinto día, que se utilizará para construir una matriz sagital. Coloca una tira de plástico resistente en el fondo del recipiente de cristal, asegurándote de dejar ambos extremos sobresaliendo de los bordes del recipiente. Esta tira facilitará la extracción del bloque de agarosa.

Sumerge el recipiente aproximadamente hasta la mitad en un cubo de hielo húmedo. En un vaso de precipitados de cristal, calienta 150 mililitros de PBS a 90 grados centígrados y añade seis gramos de agarosa, removiendo constantemente. Vierte lentamente la solución al 4% de agarosa para crear una capa de medio a un centímetro de grosor en el fondo del recipiente y deja que se solidifique.

Recubre completamente el cerebro con una fina capa de aceite mineral para evitar que la agarosa se una a la superficie cerebral o quede atrapada en el surco. El aceite también facilita mucho la gestión de la extracción del cerebro del gel de agarosa. Una vez recubierta, coloca el cerebro sobre la fina capa de agarosa en la orientación deseada para un moho coronal o sagital lo más recto y erguido posible.

Deja que la solución de agarosa se enfríe hasta 50 grados Celsius mientras se remueve constantemente para conservar una viscosidad vertible. Luego vierte la solución de agarosa sobre el cerebro hasta que esté completamente incrustada. Deja que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.

Corta la capa de agarosa sobre el cerebro con una sonda quirúrgica siguiendo el contorno cerebral. Una vez que el corte esté completo alrededor del cerebro, usa una espátula fina para levantar suavemente la capa superior de la agarosa. Ten cuidado de no cortar ni cortar el cerebro durante estos pasos.

Retira suavemente todo el cerebro del moho. Debería salir relativamente fácil gracias al aceite mineral que se aplicó antes en la superficie. Asegúrate de eliminar cualquier trozo pequeño de gel de agarosa que pueda haber caído en la impresión.

Calienta 98 mililitros de PBS en un vaso a 9 grados Celsius y añade cuatro gramos de agarosa y dos mililitros de tinta india. Remueve bien. Vierte esta solución de agarosa negra en la impresión que produce el cerebro, cuidando de no desbordar la impresión.

Deja que el gel negro se solidifique. Sujeta ambos extremos de la tira de plástico y levanta todo el bloque de agarosa del recipiente. Ahora vamos a ilustrar cómo crear placas plantilla para tu matriz.

Para cortar el molde cerebral, coloca una hoja de papel a escala entre dos placas acrílicas transparentes de 76 milímetros y colócalas cerca del borde de la mesa. Luego usa abrazaderas para asegurar cuatro cuadrados de esquina y dos placas de acrílico para construir dos paredes que sujeten los bloques de agarosa firmemente en la orientación deseada. Los bordes frontales de los dos cuadrados metálicos en las esquinas y las dos placas verticales de acrílico deben estar alineados a lo largo de un lado del papel a escala.

Coloca el bloque de gel de agarosa de modo que el borde a cortar se alinee con el papel de escala y con los bordes de las placas verticales de acrílico y los cuadrados de las esquinas, y coloca un peso en el lado opuesto del bloque de agarosa para mantenerlo en posición. Recorta cualquier exceso del bloque hasta que el molde de tinta india esté a punto de ser cortado. Mueve el bloque de agarosa hacia adelante en los pasos deseados, por ejemplo, dos milímetros o cinco milímetros con la ayuda de las marcas en el papel de la escala subyacente.

Agarra la hoja firmemente con ambas manos y guíala por los bordes frontales de las placas acrílicas y los cuadrados de las esquinas para cortar el bloque. Coloca cada rebanada sobre una segunda hoja de papel de escama y presiona firmemente para transferir una impresión sobre el papel. Con un bolígrafo, haz un contorno completo de la rebanada.

Retira la rodaja y delimita el contorno cerebral identificado por la tinta india. Observa la orientación de la primera porción en el papel de la escala, por ejemplo, posterior y anterior para las secciones sagitales, y mantenla consistente cuando se añadan rodajas adicionales de gel al papel durante el proceso. Numera cada trazado secuencialmente.

Corta las placas de acrílico a 10 por 8 1/2 centímetros. Luego apilábalos y fíjalos a la fase de un taladro de prensa usando cuadros de esquina y abrazaderas. Haz tres agujeros en la pila con las coordenadas indicadas en el manuscrito.

Quita la película protectora de las placas de acrílico. Luego coloca una placa de acrílico sobre una plantilla sobre el papel de escama y alinea la parte superior de las líneas de la placa acrílica con los bordes superiores de la plantilla. Traza el contorno del cerebro en la placa de acrílico con un rotulador permanente.

Etiqueta cada matrícula para que coincida con el número de la plantilla o el rastreo cerebral. Con la sierra de cinta, corta cada placa a lo largo de las líneas de plantilla copiadas. Alternativamente, se puede usar una herramienta rotativa con punta para tallar madera para eliminar zonas no deseadas.

Pule el filo cortante usando una herramienta rotatoria con una punta de lijado para pulir para alisar los bordes, ya que los bordes afilados podrían dañar el cerebro durante los cortes. Revisa la precisión del corte colocando la placa de acrílico sobre la plantilla. Recorta y pule según sea necesario.

A continuación, ilustraremos el montaje de las placas. Preensambla la matriz apilando las placas en orden secuencial y comprueba la alineación de las placas. El montaje de matriz comienza colocando tres pernos largos de acero inoxidable a través de la primera placa de acrílico y luego colocando una arandela en cada tornillo.

Coloca la segunda placa y añade arandelas a cada tornillo. Alternativamente, las arandelas pueden pegarse alrededor de los orificios de anclaje con superpegamento para evitar tener que añadir las arandelas individualmente en cada montaje. Repite este proceso hasta que todas las placas se hayan añadido secuencialmente a los tornillos.

Ajusta todo junto con una tuerca en cada tornillo. Realiza un pulido final de los bordes orientados hacia el cerebro para lograr una transición más suave de placa a placa. Utiliza rotuladores de diferentes colores para colorear el borde superior de las placas de acrílico alternando colores y así facilitar mucho el corte.

Aquí alternábamos placas negras, rojas y sin marcar. Finalmente, demostraremos el proceso para cortar el cerebro en el plano coronal o sagital. Para cortar el cerebro, colócalo en la matriz en la misma orientación que durante el proceso de moldeo y lo más recto posible.

Necesitarás una hoja ancha y plana para cortar el cerebro. La hoja ancha limita la posibilidad de torcerse o doblarse durante el corte. Recomendamos una cuchilla criostatal de alto perfil.

Por seguridad, envuelva una longitud de aproximadamente dos centímetros de un extremo de la hoja con cinta de laboratorio para crear un espacio donde sujetar de forma segura el extremo envuelto durante el corte del cerebro. Una nota de precaución aquí. Dado que cada parte del cerebro tiene diferentes texturas tras la fijación con formalina, hay que tener cuidado de aplicar una presión uniforme sobre la hoja.

Además, el cerebro del lechón es grande, por lo que es mejor usar un movimiento de corte para cortar el cerebro que un corte directo y empujando hacia abajo. La hoja debe tirarse con fuerza constante de un lado a otro, asegurándose de bajar lo suficiente para cortar todo el cerebro. Pon todas las rodajas en una bandeja de seis pozos o bandeja de acero inoxidable llena de PBS.

Coloca cuidadosamente las rebanadas en la bandeja, manteniendo el orden y la orientación, y conserva o procede según sea necesario. Para ajustar la geometría o ampliar la cavidad y adaptarla mejor al cerebro, se pueden retirar o añadir placas acrílicas seleccionadas para adaptar la matriz a diferentes tamaños cerebrales. Aquí ilustramos la expansión de una matriz sagital construida para un cerebro de lechón P5 añadiendo varias placas, aquí de color azul y verde, a la parte media de la matriz.

La matriz es ahora adecuada para la sección sagital de un lechón P38. La capacidad de expandir o reducir el tamaño de la matriz aumenta considerablemente la flexibilidad de la matriz y puede ahorrar tanto materiales como esfuerzo. Al igual que en el corte coronal, corta cuidadosamente el cerebro en el plano sagital usando placas sucesivas para guiar la hoja.

El sistema de codificación por colores ayuda a identificar la colocación secuencial correcta de la hoja, lo cual es difícil cuando las cortes son finas. Retira el cerebro de la matriz y desmenuza suavemente las rebanadas. En conclusión, hemos desarrollado un método sencillo, económico y flexible para crear matrices cerebrales para lechones neonatales.

Este concepto puede aplicarse a cerdos mayores y a otros modelos animales grandes.