Name: Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a optimizar el flujo de trabajo IBEX con bloqueo de heparina y detección espectral para suprimir la autofluorescencia en tejidos humanos ricos en eosinófilos. Este método mejora la claridad en análisis proteómicos espaciales de alta plexación.

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<table><tbody><tr><td>Solución de ácido sulfúrico 2N (H2SO4)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 500 mL</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Placa de 6 pozos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>BCL-6 - Alexa Fluor 647</td><td>BD Biociencias</td><td>561525</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Kit de fijación/permeabilización de citofix/citoperma BD</td><td>BD Biociencias</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección de mesa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD11c - Alexa Fluor 700</td><td>BD Biociencias</td><td>561352</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD138/Syndecan-1 - PE</td><td>BioLegend</td><td>356503</td><td>Factor de dilución 1:200</td></tr><tr><td>CD20 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53020282</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD21 - Alexa Fluor 532</td><td>NovusBio</td><td>NBP2-60733AF532</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD23 - PE</td><td>BioLegend</td><td>338507</td><td>Factor de dilución 1:200</td></tr><tr><td>CD3 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>100320C0</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD31 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303134</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD34 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>103400C0</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD38 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303523</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD4 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>300520</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD45 - Alexa Fluor 532</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>58045942</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>353113</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Adhesivo de alumbre y gelatina de cromo</td><td>Suministro de Nuevos Jugadores</td><td>1033A</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>NC9511236</td><td>Además, el número de catálogo 50-465-347 para muestras más grandes</td></tr><tr><td>Diapositiva de calibración DAPI</td><td>Agar Scientific</td><td>AG2273</td><td></td></tr><tr><td>Solución DAPI, 1 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Factor de dilución 1:3000</td></tr><tr><td>E-cadherina/CD324 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>147307</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594</td><td>BioLegend</td><td>324228</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf/Falcon</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>FoxP3 - eFluor 660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50577382</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de extremo esmerilado</td><td>ChemScience</td><td>GEW45-2575-W</td><td></td></tr><tr><td>GL7 - Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53590282</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>10KU</td></tr><tr><td>HLA-DR - PE</td><td>NovusBio</td><td>NB100-77855PE</td><td>Factor de dilución 1:200</td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (solución bloqueadora de receptores Fc)</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Cámara de humedad</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Cubo de hielo con tapa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>IgD - Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>348215</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>IL4Ra/CD124 - PE</td><td>BioLegend</td><td>144803</td><td>Factor de dilución 1:200</td></tr><tr><td>Convertidor de archivos Imaris</td><td>Instrumentos OXFORD</td><td>N/A</td><td>Cubrir cualquier formato de archivo de imagen al formato .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)</td></tr><tr><td>Isopentano (2-metilbutano)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Ki-67 - Alexa Fluor 488</td><td>BD Biociencias</td><td>558616</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark limpiaparabrisas delicados de tareas delicadas de Kimtech Kimtech Science Kimwipes, 1 capa</td><td>Ciencia Kimtech</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas grandes (es decir, de 25 cm de largo)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Borohidruro de litio (LiBH4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>222356</td><td></td></tr><tr><td>MECA-79 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53603680</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Tapa de portaobjetos de microscopio Vidrio nº 1 22x50 mm</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Agua Milli-Q</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>MUC2 - Alexa Fluor 488</td><td>NovusBio</td><td>NB120-11197AF488</td><td>Factor de dilución 1:100</td></tr><tr><td>Tapa de recámara Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Lápiz PAP</td><td>ABCAM</td><td>AB2601</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Lo que esté disponible o usado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Extensiones SimpleITK Imaris</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Software utilizado para alinear imágenes de diferentes rondas (https://github.com/niaid/imaris_extensions)</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980</td><td>Microscopía ZEISS</td><td>N/A</td><td>El sistema de imagen utilizado en este estudio</td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>Microscopía ZEISS</td><td>N/A</td><td>El software utilizado para el procesamiento de imágenes tras la adquisición</td></tr></tbody></table>

imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

High-plex Imaging using Spectral Confocal Microscopy to Minimize Non-specific Tissue Fluorescence

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

Highly multiplexed imaging enables the study of functionally diverse cells and their niches within their native tissue environments. Iterative Bleaching ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Hemos desarrollado una nueva técnica para cuantificar los cambios de los receptores nicotínicos de acetilcolina en las regiones subcelulares de los subtipos específicos de neuronas del sistema nervioso central para comprender mejor los mecanismos de la adicción a la nicotina mediante el uso de una combinación de enfoques que incluyen el etiquetado proteína fluorescente del receptor con el golpe-en el enfoque y espectral imagen confocal.

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Deposición amiloidea es una seña de identidad de distintas enfermedades y afecta a muchos órganos diferentes. Este trabajo describe la aplicación de la fluorescencia oligothiophene conjugado luminiscente tinción en combinación con técnicas de microscopía de fluorescencia. Este método de coloración representa una poderosa herramienta para la detección y exploración de agregados proteicos en ajustes clínicos y científicos.

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Las imágenes espectrales se han convertido en una solución fiable para la identificación y separación de múltiples señales de fluorescencia en una sola muestra y pueden distinguir fácilmente las señales de interés del fondo o la autofluorescencia. Las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación mejoran esta técnica al reducir el tiempo de adquisición de imagen necesario y, al mismo tiempo, aumentar la relación señal-ruido.

Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Aquí, se presenta un protocolo para extraer y catalogar ópticamente firmas de fluorescencia celular innata (es decir, autofluorescencia celular) de cada célula viva individual distribuida en un espacio tridimensional. Este método es adecuado para estudiar la firma de fluorescencia innata de diversos sistemas biológicos a una resolución de una sola célula, incluidas las células de bacterias, hongos, levaduras, plantas y animales.

Reconstrucción de firmas de fluorescencia innata unicelular mediante microscopía confocal

Aquí se describe un método que se puede utilizar para obtener imágenes de cinco o más parámetros fluorescentes mediante microscopía inmunofluorescente. Se describe una línea de análisis para extraer células individuales de estas imágenes y realizar análisis de células individuales a través de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, que pueden identificar subconjuntos de células en secciones de tejido.

Generación y análisis de imágenes histológicas de alto parámetro con citometría de histoflujo

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Aprende a optimizar el flujo de trabajo IBEX con bloqueo de heparina y detección espectral para suprimir la autofluorescencia en tejidos humanos ricos en eosinófilos. Este método mejora la claridad en análisis proteómicos espaciales de alta plexación.

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

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