Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

Optimizamos un flujo de trabajo IBEX que combina bloqueo de heparina y detección espectral para suprimir el fondo en tejidos humanos ricos en eosinófilos. La autofluorescencia y la unión de gránulos eosinófilos oscurecen la señal verdadera. Ambos objetivos son habilitar mapas limpios de alto Plex.

Para empezar, dibuja un círculo en la corredera de cristal alrededor del pañuelo montado usando un bolígrafo para crear una barrera hidrofóbica. Añade aproximadamente 100 microlitros de PBS a cada tejido para rehidratarlos, e incuba el portaobjetos durante unos dos minutos a temperatura ambiente para eliminar el compuesto a temperatura óptima de corte. Aspira el PBS alrededor del tejido usando una pipeta Pasteur de vidrio de succión.

Luego añade 100 microlitros de tampón bloqueador a cada tejido e incuba a temperatura ambiente en una cámara de humedad durante una hora. Ahora aspira el buffer de bloqueo usando una pipeta. Añade 100 microlitros de tinte mezclados en cada tejido e incuba el portaobjetos en una cámara de humedad cubierta dentro de un frigorífico a cuatro grados Celsius durante la noche.

De manera similar, se prepara la tinción en sección con un solo fluoróforo y un control negativo sin ninguna tinción para definir el espectro de fluoróforos y la autofluorescencia tisular. Después de aspirar la mezcla de tinción, lava el pañuelo tres veces con PBS y aspira el líquido tras cada lavado. Monta la muestra en el microscopio para la imagen.

Enfoca la muestra usando el modo de contraste de campo brillante o interferencia diferencial. Luego cambia al modo fluorescencia y configura los parámetros de adquisición espectral según los requisitos experimentales. Asigna los láseres adecuados para los fluoróforos utilizados en el experimento.

Selecciona un divisor de haz que corresponda a las líneas láser elegidas. Permitir que todos los detectores capturen todo el espectro de emisión y ajustar la resolución de adquisición de imagen a una de las resoluciones predefinidas. O elige la resolución máxima.

Ajusta el tamaño del orificio estenopeico a una unidad de área para una sección óptica óptima. Optimiza los ajustes del láser antes de la adquisición. Usando una sección teñida con todos los marcadores, inicia el modo de escaneo continuo a baja potencia láser.

Ajusta la ganancia maestra de cada detector así como las intensidades láser hasta que todos los marcadores sean identificables con una buena relación señal-fondo. Ajusta finamente las intensidades del láser y alterna iterativamente entre secciones de tinción única y secciones de varias tinciones hasta que todas las señales de fluoróforo sean visibles sin sobresaturación. Activa la función de mosaicos en el software de adquisición y define la región de adquisición de losa alrededor del tejido para asegurar la cobertura completa de la imagen.

Optimiza el enfoque para la región de adquisición de la baldosa en el centro del tejido. Identifica una característica estructural única, como un conjunto distinto de células en una disposición reconocible, que sirva como referencia para la alineación en rondas de imagen posteriores. Ahora activa la función Z-stack y navega a la pestaña Z-stack.

En la pestaña central, establece el número de cortes en al menos seis con un intervalo de no menos de un micrómetro entre rebanadas. Haz clic en el botón central para establecer el punto de enfoque actual determinado en el paso anterior como la porción central de la pila. Haz clic en el botón de iniciar experimento para iniciar la adquisición de la imagen.

Una vez completada la adquisición, haz clic derecho en la miniatura de la imagen, selecciona Guardar como. Elige la ubicación de un archivo y nombra la imagen. Haz una copia de seguridad de los datos de la imagen para almacenarla de forma segura. Desmezclar la imagen usando los mismos ajustes optimizados aplicados durante la adquisición de regiones en mosaico.

Captura un snap de cada control con una sola tinción para obtener el espectro real de señal y del control sin tinte, para capturar fondo o autofluorescencia. Utiliza estas imágenes exclusivamente para la desmezcla espectral. Confirma que la región seleccionada representa una señal real comprobando que la intensidad y morfología estén ausentes o sean equivalentes a los niveles de fondo en el control no teñido y que la localización de los marcadores coincida con su patrón celular esperado, como la distribución de membrana, nuclear, citoplásmica o secretada.

Abre la imagen instantánea en el software. Haz clic en la pestaña de desmezclar y selecciona una de las herramientas de selección de regiones en la pestaña de herramientas no mezcladas, dibuja una región de interés o ROI alrededor de la señal positiva para generar el espectro de esa región. Comparar cada espectro generado con el espectro teórico de emisiones del fluoróforo correspondiente.

Asegúrate de que la región represente con precisión la señal verdadera. Nombra cada espectro según la identidad del fluoróforo y guárdalo en la base de datos espectral. Después, carga la imagen en mosaico y abre la herramienta de desmezcla.

Usa el botón más para añadir los espectros de referencia de cada fluoróforo a la lista de desmezcla. Haz clic en el botón de desmezclado lineal para separar las señales espectrales y guardar la imagen sin mezclar. Prepara la solución blanqueadora en una campana extractora.

Usando una microespátula, pesa 10 miligramos de borohidruro de litio directamente en un vaso seco. Añade cuidadosamente 10 mililitros de agua ultrapura al vaso y mezclad hasta que el compuesto esté completamente disuelto. Añade aproximadamente 100 microlitros de la solución blanqueadora recién preparada a cada sección de tejido usando una pipeta Pasteur de cristal e incuba las láminas a temperatura ambiente durante 15 minutos dentro de la campana extractora.

Si el violeta brillante blanqueador muere, transfiere cuidadosamente el portaobjetos a un microscopio epifluorescente y selecciona el filtro de dappy. Enfoca la muestra e iluménala a máxima potencia. Ahora usa un objetivo 5X para lograr un mayor campo de iluminación y baja completamente la etapa para evitar cualquier contacto entre la corredera y el objetivo o la carcasa.

Finalmente, decantar la solución de borohidruro de litio de cada pozo usando una pipeta de vidrio Pasteur y devolverla al vaso original de solución blanqueadora. Lava las láminas tres veces con tampón de dilución y incuba durante aproximadamente tres minutos en cada lavado. Añade la mezcla de anticuerpos y tiñe la muestra, como se ha demostrado antes.

En el tejido pólipo nasal no tratado, la tinción con CD3, CD4 y CD20 mostró una intensa fluorescencia granular inespecífica en regiones ricas en eosinófilos. Mientras que la señal localizada en membrana verdadera estaba presente a menor intensidad. El pretratamiento con leche desnatada al 5% no logró bloquear completamente la fluorescencia inespecífica y también redujo la intensidad de la señal para fluoróforos como AF 532.

El pretratamiento con dab redujo la fluorescencia inespecífica de CD20, CD3 y CD4, pero también disminuyó la intensidad real de la señal en múltiples canales, incluyendo DAPI y AF 532. El pretratamiento con heparina bloqueó eficazmente la unión inespecífica manteniendo una alta intensidad de señal para CD3, CD4, CD20 y DAPI. La heparina bloqueó la señal inespecífica de forma dependiente de la concentración, logrando una supresión completa en 10 unidades y sin efectos perjudiciales observados a concentraciones más altas.

Un sistema de imagen de tres pistas redujo el tiempo de adquisición, pero introdujo diafonía que incluía la filtración de la AF 594 hacia el canal PE, y una autofluorescencia tisular mejorada debido a múltiples excitaciones láser. La imagen espectral eliminó casi todo el fondo y la diafonía, al tiempo que redujo el tiempo de adquisición y mejoró la relación señal-fondo. La imagen espectral IBEX de un pólipo nasal humano reveló estructuras epiteliales marcadas por EpCAM.

células inmunitarias como los linfocitos positivos para CD3 y positivo para CD20, y vasos que expresan CD31 y CD34. El tratamiento con heparina eliminó la unión de gránulos sin reducir la señal, manteniendo una fuerte supresión de fondo a lo largo de los ciclos IBEX. La mezcla espectral minimiza el filtro, la autofluorescencia aumenta la señal al fondo y acelera significativamente la adquisición de múltiples paneles frente a la confocal multipista.

Esto permite una proteómica espacial robusta y tejidos desafiantes que apoyan un mapeo preciso del estado celular y un análisis a nivel de vecindad.