Avances en el perfil metabólico de esferoides tumorales cerebrales tridimensionales para la detección de fármacos

La investigación tiene como objetivo optimizar la formación de raíces celulares celulares 3D para estudiar el metabolismo energético utilizando la tecnología Seahorse, centrándose en la actividad metabólica del comportamiento celular y las respuestas a los fármacos en nuestro modelo clínicamente relevante. Estos hallazgos mejorarán los modelos de fundición de fármacos al proporcionar una representación más precisa de los tumores cerebrales, mejorar la evaluación de la terapia y el análisis metabólico para mejorar las estrategias de tratamiento. Los resultados allanaron el camino para investigar cómo se altera el metabolismo energético en modelos esferoides 3D, cómo los efectos de salida de los fármacos en las vías metabólicas y los mecanismos por los cuales los cambios metabólicos contribuyen al desarrollo de resistencia tumoral a la terapia.

Después de volver a suspender las células U87 recolectadas en DMEM, precaliente el medio no utilizado a 37 grados Celsius. Mantenga las suspensiones celulares a temperatura ambiente durante 30 minutos. Con base en el recuento inicial de células, diluya la suspensión celular con DMEM que contenga 10% de FBS hasta un volumen final de 20 mililitros, asegurando aproximadamente 200, 000 células.

Mezcle bien la suspensión celular final mediante inversión repetida. Agregue lentamente 200 microlitros de la suspensión a lo largo del borde de cada pocillo en una placa transparente de fondo redondo de 96 pocillos, luego selle la placa herméticamente con Parafilm para evitar fugas durante la centrifugación. Coloque la placa sellada en la centrífuga y déjela funcionar a 200 g durante dos minutos para granular las células en el fondo de cada pocillo.

Retire la placa de la centrífuga. Retire con cuidado el Parafilm y coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5%. Para preparar una solución de recubrimiento, disuelva cinco miligramos de poli-D-lisina en 50 mililitros de agua estéril y mezcle bien la solución hasta que se disuelva por completo.

Agregue 30 microlitros de la solución de recubrimiento a cada pocillo de la placa de ensayo metabólico. Asegure la ausencia de burbujas agitando suavemente la placa o aspirando el exceso de solución. Incube la placa con la tapa puesta durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego aspire la solución de recubrimiento y lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de agua estéril.

Seque al aire la placa durante al menos 30 minutos, luego caliente la placa a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono durante 30 minutos para estabilizar el recubrimiento. Luego, agregue 175 microlitros de medio precalentado a cada pocillo. Mantenga la placa a 37 grados centígrados en una incubadora sin dióxido de carbono, hasta que esté lista para la transferencia de esferoides celulares.

Transfiera las placas esferoides a un sistema de imágenes de alto contenido después de cinco días de cultivo. Para configurar los parámetros de imagen, establezca la temperatura en 37 grados Celsius y el nivel de dióxido de carbono en 5%Ajuste el tipo de placa, los canales y el rango de enfoque en la configuración del sistema. A continuación, adquiera imágenes de esferoides utilizando un microscopio confocal con objetivos de 10 veces y el software de imágenes, luego identifique los pocillos que contienen esferoides intactos y registre sus posiciones para su transferencia.

Asigne los esferoides intactos a dos grupos, un grupo de control con seis pocillos replicados y un grupo de tratamiento con seis pocillos replicados para el tratamiento con fenofibrato. Preparar la solución de trabajo de fenofibrato en medio fresco precalentado a la concentración óptima. Retire con cuidado el esferoide que contiene la placa de baja adherencia del sistema de imágenes y colóquelo sobre una superficie estéril dentro de un gabinete de bioseguridad.

Coloque la placa de ensayo recubierta de poli-D-lisina adyacente a ella para transferirla, luego recorte la punta de una pipeta de 20 microlitros para permitir una aspiración suave de los esferoides celulares sin causar daños. Con la punta de pipeta recortada, aspire suavemente cada esferoide intacto del fondo de su pocillo. Transfiera cada esferoide al pocillo correspondiente de la placa recubierta y déjelo reposar durante 20 segundos.

Transfiera las placas de ensayo de esferoides 3D a un sistema de imágenes de alto contenido. Para analizar los datos morfológicos, aplique el módulo de región de textura para separar de forma gruesa los esferoides 3D del fondo dividiendo el contenido de la imagen en tres grupos en función de las características de textura. Aplique el módulo de búsqueda de región de imagen para refinar la separación de esferoides 3D preaislados mediante el uso de características de tamaño basadas en el volumen, lo que garantiza que se eliminen las impurezas y se conserven los esferoides intactos.

Mida los parámetros morfológicos de los esferoides 3D utilizando el módulo de propiedades de morfología. Aplique el módulo de selección de población para filtrar y conservar solo los esferoides de células 3D genuinos y, a continuación, exporte los resultados de los datos morfológicos. Los esferoides se formaron visiblemente al quinto día de cultivo, manteniendo una morfología esférica uniforme en todas las muestras observadas.

También se observó un esferoide desintegrado con integridad estructural visiblemente alterada el quinto día. El análisis posterior a la transferencia reveló que tanto los esferoides 3D tratados con fenofibrato como los de control permanecieron intactos en la mayoría de los casos, pero algunos esferoides tratados con fenofibrato se desintegraron. La tasa de consumo de oxígeno se redujo significativamente en los esferoides tratados con fenofibrato en todos los puntos temporales en comparación con el grupo de control.