Detección de alteraciones dirigidas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas mediante secuenciación de próxima generación

Mi investigación descubre mutaciones genéticas en el cáncer para mejorar el diagnóstico y el tratamiento. Para empezar, registra la información de la muestra en el Sistema de Gestión de Información de Laboratorio y rellena el formulario de consentimiento informado para la prueba de mutaciones génicas. Utilizando cuchillas desechables de microtomo, cortar secciones del cáncer de pulmón no de células pequeñas, la muestra formal y fija incrustada con parafina.

Después, realiza tinciones rutinarias de hematoxilina y eosina para evaluar el contenido celular tumoral. Para la extracción de ácidos nucleicos, utilizando un microtomo, se secciona el bloque formal y fijo incrustado de parafina para obtener una cinta, y se coloca la cinta en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Transfiere el tubo a la ubicación designada de entrada de la muestra en el instrumento de extracción automatizado.

A continuación, utiliza un instrumento de extracción automática con un kit de extracción automática. Sustituye los pasos manuales de pipeteo por un sistema automático de extracción de ácidos nucleicos con perlas magnéticas. Luego selecciona el programa C1102 en el instrumento.

Elige el tiempo de incubación de la muestra para descerar como 16 horas y ajusta el volumen eluciano a 100 microlitros. Utiliza espectrofotometría para verificar la pureza del ADN. Luego se utiliza un kit de detección con tintes fluorescentes específicos de secuencia para realizar un ensayo fluorométrico y así medir con precisión la concentración de ADN.

Para preparar ADN genómico fragmentado mediante ultrasonicación, mezclar 200 nanogramos de ADN genómico en 50 microlitros de tampón de tris-EDTA bajo. Coloque el tubo de muestra en una rejilla preenfriada, mantenida a ocho grados Celsius. Establece los parámetros del instrumento según el protocolo e inicia la fragmentación del ADN.

Para iniciar la preparación automática de la biblioteca, pulsa el botón de encendido para activar el sistema y espera a que se complete la inicialización. Navega a configuración del programa, selecciona ejecutar protocolo y elige protocolo BurningRock HS. Ajusta el tipo de muestra a ADN de alta calidad, cantidad de nanogramos de entrada a 50, ciclos pre-PCR a 12 y ciclos post-PCR a 12. Luego haz clic en Ejecutar para continuar.

Luego inserta el cartucho de reactivo preenvasado en la ranura designada del instrumento, lo que validará automáticamente la colocación y el estado del reactivo. Después de cargar las muestras, pulsa start para iniciar la ejecución autónoma. Observa los indicadores LED en el sistema para monitorizar el progreso.

Una vez finalizado el programa, haz clic en OK para confirmar y el sistema transferirá automáticamente la biblioteca final al tubo biblioteca, completando la preparación de la biblioteca. Mide la concentración tanto de la biblioteca previa como de la biblioteca total usando fluorometría. Diluir la biblioteca de secuenciación a 1,6 picomolar y 1300 microlitros para operaciones de secuenciación.

Controla el entorno de secuenciación manteniendo una temperatura interior y humedad interior. Control de calidad completo de los datos de salida del instrumento verificando la calidad base por encima de Q 30 y filtro paso de densidad de clúster. El flujo de trabajo optimizado de detección identificó de forma fiable varias alteraciones genómicas clínicamente accionables en muestras tumorales representativas.

Los resultados de la secuenciación demostraron una frecuencia de alta frecuencia p. Mutación missense L858R, acompañada de una amplificación significativa del número de copias del gen EGFR. Se observó una amplificación moderada del gen MET y una amplificación de bajo nivel del gen BRAF.

La muestra mostró una carga de mutaciones tumorales intermedias y un estado estable de microsatélites. Todos los loci génicos objetivo, incluyendo ALK, BRAF, KRAS y ROS1, alcanzaron una tasa de detección del 100% en cuatro experimentos de replicación. Cada mutación fue detectada de forma consistente en los cuatro experimentos repetidos, con valores de abundancia esperados manteniéndose dentro del rango normal de fluctuación; NJS proporciona un perfil genético compresivo para el cáncer de pulmón no de células pequeñas al detectar genes comunes, raros y nuevos al mismo tiempo.

Nuestra futura investigación se centrará en combinar patología molecular con inteligencia artificial para explorar nuevos biomarcadores para el cáncer de pulmón.