Procedimiento de muestreo basado en hilo rojo de fenol para lipidómicos de fluidos lagrimales no dirigidos en el descubrimiento de biomarcadores
December 12th, 2025
Este protocolo describe un protocolo clínico único para la recogida de muestras de fluido lacrimal humano utilizando hilos rojos de fenol y un flujo de trabajo basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas tándema (LC-MS/MS) para descubrir el perfil lipidómico de las lágrimas. El método simple de separación bifásica entre metil-tert-butil (MTBE)/metanol permite una extracción rápida de lípidos lagrimales con alta recuperación para el descubrimiento de biomarcadores desgarradore
Establecimos un método más estandarizado y fácil de operar basado en hilo rojo de fenol para ayudar a lograr perfiles lipidómicos de desgarros reproducibles para futuros descubrimientos de biomarcadores de lágrima. El desafío actual es que las tiras de Schirmer irritan mientras que los capilares muestran variabilidades de los operadores en la recogida de lágrimas. Esto dificulta la reportabilidad experimental y las comparaciones entre estudios.
Para empezar, lleva guantes y desinfecta a fondo la estación de trabajo para evitar cualquier contaminación de la muestra. Sujeta el hilo rojo fenol por el extremo opuesto al gancho doblado, asegurándote de no tocar la zona del gancho doblado. Pide al sujeto que dirija la mirada hacia la dirección nasal superior.
Luego tira suavemente del párpado inferior del sujeto e inserta el hilo rojo fenol con el gancho doblado colocado en la conjuntiva palpebral temporal inferior, cerca de la esquina externa del ojo. Ahora, pide al sujeto que cierre los ojos suavemente y incline ligeramente la cabeza hacia adelante para evitar que el hilo rojo fenol toque la piel de la cara. Baja de nuevo el párpado inferior del sujeto y retira suavemente el hilo rojo fenol, evitando el contacto con la zona muestreada.
Registra la longitud de la región roja muestreada. Y usando pinzas estériles, transfiere la PRT a un nuevo tubo de muestra. Ahora etiqueta y tapa correctamente el tubo de muestras.
Si la longitud muestreada es inferior a 50 milímetros, pide al sujeto que descanse entre uno y tres minutos y luego repite la recogida del líquido lacrimal usando el mismo ojo. Coloca cada PRT recién muestreado en un tubo de muestra separado. Utiliza metanol y toallitas limpias de papel, limpia bien los guantes y las pinzas para eliminar cualquier residuo de lágrimas o contaminantes.
Luego déjalas secar completamente al aire. Sella todos los tubos de muestra con parafilm y guárdalos inmediatamente a menos 20 grados Celsius para almacenamiento temporal o menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Prelava las microtijeras y las pinzas con metanol antes de tratar los hilos rojos de fenol.
Corta el extremo doblado del gancho aproximadamente los primeros tres milímetros de cada hilo rojo fenol. Corta la región muestreada hasta la parte frontal del tinte rojo fenol en trozos de dos milímetros y recóllese estos segmentos con un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros orgánico tolerante a disolventes. Descarta el extremo doblado del gancho y la zona no deseada del PRT.
Coloca las muestras sobre hielo para mantener una temperatura baja antes de la extracción. Ahora, añade 232 microlitros de metanol de grado espectrometría de masas helado a cada muestra y haz un vórtice durante 15 segundos para mezclar bien. Sonica las muestras en un limpiador ultrasónico preenfriado durante 15 minutos.
Luego añade 774 microlitros de metil-tert-butílico grado HPLC y 194 microlitros de agua desionizada a cada muestra. Vuelve a usar el vórtice durante 15 segundos para mezclar bien los disolventes. Sonica las muestras de nuevo en un limpiador ultrasónico preenfriado durante otros 15 minutos.
Después de la sonicación, incubar las muestras en un termomezclador ajustado a cuatro grados Celsius con agitación a 1.200 revoluciones por minuto durante ocho horas. Luego deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifuga las mezclas a 10.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.
Tras la centrifugación, asegúrese de que las mezclas estén visiblemente separadas en dos fases líquidas distintas. Recoge cuidadosamente 700 microlitros de la fase orgánica superior que contiene lípidos y transfiere a un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado. Descarta la fase acuosa inferior, que contiene éter metil-tert-butílico residual y metanol como residuos químicos peligrosos.
Seca los extractos lipídicos usando un concentrador SpeedVac refrigerado a cuatro grados Celsius durante cuatro horas. Luego se almacenan los extractos de lípidos secos a menos 20 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Prepara la mezcla de metanol-cloroformo mezclando metanol con cloroformo en una proporción de volumen uno a uno.
Reconstituye los extractos lipídicos secos usando 50 microlitros de la mezcla de disolvente metanol-cloroformo bien fría. Sonica la solución reconstituida en un limpiador ultrasónico preenfriado durante 15 minutos. Ahora, centrifuga los extractos lipídicos reconstituidos a 14.000 g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Transfiera cuidadosamente 40 microlitros del sobrenadante resultante a un frasco de vidrio automuestreador equipado con un inserto de vidrio. Tapa firmemente el vial con una tapa abierta del tabique abierto sin rendija para prepararlo para el análisis de espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida. Utilizando criterios estrictos, se identificaron 773, 890 y 1.025 especies lipídicas únicas en los grupos de muestra replicar uno, replicar dos y replicar tres respectivamente.
El modo iónico positivo identificó 1.302 especies lipídicas con identificaciones de grado A del 26%, 13,2% de grado B y 60,8% de grado C. El modo iónico negativo identificó 257 especies de lípidos con aproximadamente 8,2% de grado A, 22,9% de grado B y 68,9% de grado C. A pesar de las variaciones relacionadas con el almacenamiento, se identificaron de forma consistente 394 especies de lípidos únicos en los tres conjuntos muestrales.
El coeficiente de variación entre sujetos en tres visitas fue del 21,5% en modo positivo y del 31,3% en modo negativo. Este protocolo aborda la ausencia de un flujo de trabajo estandarizado para el análisis lipidómico de lágrimas reproducibles y puede mejorar la comparabilidad entre estudios. Nuestro método basado en PRT minimiza la irritación, permite una rápida recogida de desgarros y reduce la variabilidad del operador.
Nuestra investigación futura validará biomarcadores lipidémicos de desgarros en grandes cohortes e integrará la multiómica para diagnósticos personalizados.
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Visión general
Este protocolo describe un método estandarizado para la recolección de muestras de fluido lagrimal humano utilizando hilos de fenol rojo, con el objetivo de mejorar la reproducibilidad en estudios lipidómicos lagrimales. El flujo de trabajo incorpora cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la extracción y análisis de lípidos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Investigación clínica
Antecedentes
- Los métodos actuales para la recolección de lágrimas a menudo conducen a irritación o variabilidad.
- La estandarización es crucial para el descubrimiento confiable de biomarcadores.
- Los hilos de fenol rojo ofrecen una alternativa menos invasiva para el muestreo de lágrimas.
- LC-MS/MS proporciona una plataforma robusta para el análisis lipidómico.
Propósito del estudio
- Establecer un método reproducible para el perfil lipidómico lagrimal.
- Minimizar la variabilidad del operador y mejorar la comparabilidad entre estudios.
- Facilitar futuras investigaciones sobre biomarcadores de lípidos en lágrimas.
Métodos utilizados
- Recolección de muestras de lágrimas utilizando hilos de fenol rojo.
- Extracción de lípidos utilizando un método de separación bifásico.
- Análisis de especies lipídicas mediante LC-MS/MS.
- Almacenamiento de muestras a temperaturas controladas para su estabilidad.
Resultados principales
- Identificación de más de 1,300 especies de lípidos en modo de iones positivos.
- Identificación consistente de 394 especies de lípidos únicas entre las muestras.
- Variabilidad entre sujetos medida en 21.5% en modo positivo.
- El método mejora la reproducibilidad y comparabilidad de los estudios lipidómicos.
Conclusiones
- El método del hilo de fenol rojo reduce la irritación y la variabilidad.
- El flujo de trabajo estandarizado mejora la fiabilidad del análisis lipidómico lagrimal.
- Los estudios futuros se centrarán en la validación de biomarcadores de lípidos en cohortes más grandes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
