Caracterización de la secreción de vesículas extracelulares derivadas de adipocitos utilizando un modelo ratón reportero CD63-GFP in vivo e in vitro

Estudiamos la vesícula extracelular derivada de adipocitos, las EV, para definir sus funciones en el tejido adiposo, especialmente cómo regulan la interacción entre los adipocitos maduros y sus células progenitoras. Actualmente no existen sistemas in vivo para estudiar las secreciones de los EV de adipocitos, y los protocolos de purificación existentes aún no están completamente optimizados. Para empezar, utiliza una técnica estéril para extirpar tejido adiposo inguinal de ratones eutanasiados.

Coloque un gramo de tejido en un tubo de dos mililitros que contenga 0,5 mililitros de buffer digestivo. Con tijeras estériles, pica el tejido en piezas no mayores de un milímetro. Suspender el tejido picado en 10 mililitros de buffer digestivo que contenga 0,5 miligramos por mililitro de Liberasa y 50 unidades por mililitro de DNasa I. Incubar la muestra a 37 grados Celsius sobre un agitador orbital.

Durante la incubación, invierte suavemente el tubo varias veces. Cuando la solución aparece turbia y no quedan fragmentos de tejido visibles, la digestión se completa. Para aislar la fracción vascular estromal, o SVF, se diluye la suspensión digerida con dos volúmenes de buffer digestivo.

Invierte suavemente el tubo tres o cuatro veces para mezclar bien. Pasa la suspensión por un filtro estéril de 100 micrómetros para eliminar el tejido no digerido y luego centrifuga el filtrado a 300g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Etiqueta el pellet como SVF.

Incubar la fracción vascular estromal en un tampón de lisis de glóbulos rojos recién preparado sobre hielo durante cinco minutos, protegido de la luz. Añade dos volúmenes de buffer de lavado y centrifuga a 400g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Resuspende la fracción vascular estromal en 80 microlitros de tampón por gramo de tejido y transfiere el contenido a un nuevo tubo.

Añade 20 microlitros de cóctel de agotamiento de progenitores no adipocitos por gramo de tejido. Incuba la muestra durante 15 minutos a dos a ocho grados Celsius en la oscuridad. Pasa la muestra por una columna LS y recoge el flujo que contiene la fracción celda negativa para el linaje.

Centrifuga el flujo a 300g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para obtener las células progenitoras de los adipocitos. Incubar 250 microlitros de células progenitoras aisladas de adipocitos de ratón en portaobjetos de cámara de ocho pozos recubiertos de colágeno durante seis horas. Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos para preservar las estructuras celulares y extracelulares de las vesículas para la imagen.

Después, lava las láminas tres veces con PBS y luego monta con medio anti-desvanecimiento. A continuación, tras contar las células progenitoras de los adipocitos, suspenderlas y diluir el tinte de viabilidad. Incuba en hielo durante 20 minutos, protegido de la luz.

Lava las celdas una vez con el buffer de lavado y la centrífuga. Suspende las células en un tampón de tinción brillante para que la concentración final sea de 1 millón de células por cada 100 microlitros. Bloquea la unión inespecífica añadiendo un reactivo bloqueador del receptor Fc en una proporción de uno a 100 e incuba.

Centrifuga libremente el anticuerpo SCA-1 a 6000g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Añade el anticuerpo SCA-1 al tubo APC con una dilución de uno a 100, luego coloca el tubo sobre hielo, protegido de la luz. Lava las células dos veces con un mililitro de tampón de lavado, luego centrifuga a 300g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Suspende las células en un buffer de lavado para la clasificación de citometría de flujo, luego adquiere los datos de células positivas en SCA-1 y GFP positivas en un citómetro de flujo espectral equipado con láser violeta y azul. Para comenzar la diferenciación, cubre los platos con gelatina al 0,2% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Siembra APCs recién aislados en medio suplementado de DMEM/F12 e incuba hasta la confluencia.

Sustituye el medio desde el primer al octavo día por el medio de diferenciación adipogénica MesenCult. En el noveno día, lava los adipocitos dos veces con PBS y luego sustituye el medio por un medio maduro de cultivo de adipocitos que contenga DMEM 1% BSA y 0,2% Primocina. Para aislar las vesículas extracelulares secretadas por adipocitos, primero se pasan 15 mililitros de medio de cultivo a través de un filtro de 40 micrómetros, seguido de un filtro de 30 micrómetros.

Centrifuga el filtrado a 500g durante cinco minutos y luego centrifuga el sobrenadante a 2000g durante 10 minutos para eliminar cualquier celda residual y restos. Tras pasar el sobrenadante resultante a través de un filtro de 0,8 micrómetros y transferir el filtrado a una unidad de ultrafiltración de 15 mililitros, centrifugar a 4000g durante 15 minutos para concentrar el medio. Carga la muestra concentrada en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño conectada a un colector automático de fracciones y recoge las fracciones F1 a F8.To realiza el análisis Western blot, concentrando cada fracción de 400 a 25 microlitros.

Pipetear 50 microlitros de tampón de radioinmunoprecipitación suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa al concentrado. Añadir 75 microlitros de dos tampones de carga SDS 2X para desnaturalizar la muestra y resolver proteínas en un gel de Tris-Glicina del 4% al 12%. Para el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluir muestras de vesículas extracelulares con PBS estéril filtrado de 0,1 micrómetros y mezclar suavemente.

Carga la muestra diluida en el instrumento NTA equipado con una cámara científica complementaria de óxido metálico de alta sensibilidad y un láser verde de 532 nanómetros. Establece la detección para partículas entre 10 nanómetros y 1.000 nanómetros, y dentro de una concentración de 10 hasta la potencia de seis a diez hasta la potencia de nueve partículas por mililitro. Las células progenitoras adiposas de ratones de parada-bandada/CD63GFP no mostraron puntos de proteína fluorescente verde detectables bajo microscopía confocal.

Mientras que las células de ratones AdipCD63 mostraban numerosos puntos fluorescentes fluorescentes distintivos en todo el citoplasma. El análisis de citometría de flujo mostró que el 1,2% de las células positivas en el cráneo 1 en ratones reporteros expresaban proteína fluorescente verde, en comparación con el 12,6% en ratones AdipCD63-GFP. El blot occidental de fracciones de cromatografía de exclusión de tamaño mostró que los marcadores vesiculares extracelulares CD63 y HSP70 estaban enriquecidos en las fracciones F1 y F2. Aunque no existían marcadores de retículo endoplasmático y mitocondrias, lo que confirmaba la pureza vesical.

El análisis de seguimiento de nanopartículas reveló que las vesículas extracelulares derivadas de adipocitos variaban en tamaño desde 50 hasta 500 nanómetros, y la microscopía electrónica de transmisión confirmó que las vesículas exhibían estructuras de doble membrana intactas. Western blot confirmado de eliminación del STX4 en adipocitos. La microscopía confocal mostró que las vesículas CD63-GFP positivas estaban dispersas por todo el citosol en adipocitos de tipo salvaje, pero se acumulaban cerca de la membrana plasmática en adipocitos knockout de STX4.

La concentración de vesículas extracelulares derivadas de adipocitos secretadas se redujo significativamente en los adipocitos knockout STX4 en comparación con los de tipo silvestre. Western blot de cantidades iguales de proteínas de vesículas intracelulares mostró una expresión reducida de CD63 y CD81 en adipocitos knockout STX4 en comparación con el tipo salvaje. El protocolo proporciona un sistema robusto y reproducible para estudiar la secreción de EV de adipocitos in vivo e in vitro, así como un método optimizado de purificación de EV de adipocitos.

Por primera vez, el protocolo describe y valida el uso de centrifugaciones seriales de baja velocidad combinadas con cromatografía de exclusión de tamaño para purificar vehículos eléctricos derivados de adipocitos maduros. Nuestros hallazgos nos permiten plantear nuevas preguntas sobre cómo los adipocitos utilizan las vesículas extracelulares para comunicarse con otros tipos celulares bajo condiciones fisiológicas y patológicas.