El ensayo de hemostasis de Nimega: medición simultánea fluorogénica de la generación de trombina y plasmina en un solo pozo

Mi investigación se centra en medir la hemostásis secundaria y la fibrinólisis juntas para medir el equilibrio hemostático general. La mayoría de los ensayos actuales evalúan componentes aislados de la coagulación o fibrinólisis. Este ensayo mide ambos procesos simultáneamente en un solo ensayo.

Para empezar, enciende el lector de placas de fluorescencia y deja que se equilibre hasta 37 grados Celsius. Configura los ajustes del filtro en el software poniendo el número de pares de longitudes de onda en dos. Ajusta la longitud de onda de excitación a 355 nanómetros para la trombina y 485 nanómetros para la plasmina.

Luego ajusta la longitud de onda de emisión a 460 nanómetros para la trombina y 525 nanómetros para la plasmina. A continuación, ajusta el tipo de placa a una microplaca negra Greiner de fondo plano de 96 pozos. Navega hasta Área de Lectura y define la disposición de placas usando un máximo de 20 pozos por placa.

Configura los ajustes de PMT y óptica configurando la ganancia de PMT a 200 voltios y el número de parpadeos por lectura a seis. Luego navega a Temporización para confirmar los ajustes de temporización con un tiempo total de ejecución de una hora, nueve minutos y 30 segundos, un intervalo de 30 segundos. Navega hasta Shake para confirmar un shake tres segundos antes de la primera lectura.

Navega a Más Ajustes para asegurarte de que el Orden de Lectura está configurado en Columna. Configura la configuración de Transferencia Compuesta antes de Lectura configurando el número de Transferencias Compuestas a uno y el Volumen Inicial a 120 microlitros. Comprueba que la altura de la pipeta sea de 130 microlitros, el volumen de 20 microlitros, la velocidad de un microlitro por segundo y el punto de tiempo de 14 segundos.

En Fuente Compuesta, confirma el formato de placa compuesta de 96 pozos y elige específicamente la opción Beckman 96 de 2,3 mililitros. Confirma la configuración de Layout de Puntas de Pipeta seleccionando las columnas correctas. Ahora navega a Columnas de Consejos Compuestos y selecciona las columnas correctas.

Ajusta la temperatura del agitador de microplaca a 37 grados Celsius y verifica la temperatura antes de usarla. Luego ajusta la intensidad del movimiento a 1.100 revoluciones por minuto. Después, descongelar plasma del paciente y plasma normal acumulado en un baño maria a 37 grados Celsius durante hasta 10 minutos.

Mezcla bien las muestras de plasma y verifica el descongelamiento completo sin crioprecipitado visible. Usando una pipeta, añade 80 microlitros de plasma del paciente o plasma normal agrupado a los pozos preseleccionados, utilizando una punta nueva de pipeta para cada muestra. Luego prepara la mezcla de sustrato mezclando 48 microlitros de cefalina con 48 microlitros de factor tisular.

A esto, añade un tampón de cloruro trisódico de 240 microlitros, luego una pipete de 96 microlitros de sustrato de trombina y 48 microlitros de plasmina. Pipetear 20 microlitros de la mezcla de sustrato en cada pozo. Sacudilo después.

Ahora inserta la microplaca en el lector de placas de fluorescencia y déjala equilibrarse a 37 grados Celsius durante varios minutos. Combina el tampón de cloruro trisódico, el tampón de cloruro de calcio trisódico y el activador de plasminógeno tisular para preparar el reactivo inicial. Haz un vórtice exhaustivo para mezclar.

Pipetear la mezcla inicial de reactivos en todas las filas de la columna de compuesto. Inserta la placa que contiene la mezcla de reactivos inicial en el cajón de la fuente y comienza la medición de fluorescencia. Graba señales de fluorescencia cada 30 segundos durante 70 minutos.

Mantén la placa a 37 grados Celsius durante toda la medición. Para el análisis de datos, exporta los datos de fluorescencia cinética como una tabla que contiene puntos temporales y valores de fluorescencia por pozo. Calcula la primera derivada y grafica las curvas de generación enzimática de cada pozo para visualizar la generación de trombina o plasmina a lo largo del tiempo.

El ensayo de hemostasis permitió la medición simultánea y resolutiva en tiempo de la generación de trombina y plasmina para proporcionar una evaluación integrada de la coagulación y la fibrinólisis. Se pueden derivar varios parámetros de la curva de generación de la trombina, incluyendo el tiempo de retraso, la altura máxima y el potencial de trombina. Tiempos de retraso más largos, picos más bajos y potenciales de trombina reducidos indican una generación de trombina deteriorada.

La curva de generación de la plasmina también proporciona múltiples parámetros, incluyendo el tiempo de lisis de la fibrina y la altura del pico de la plasmina. Tiempos de lisis de fibrina más cortos y alturas máximas más altas reflejan una generación de plasma mejorada. Las curvas de generación de trombina y plasma de tres controles sanos y plasma agrupado normal mostraron un pico reproducible en el momento de altura y extremo de la altura, sirviendo como perfiles de referencia para la función hemostática normal.

En un paciente con factor V de 3% de la generación de trombina estuvo completamente ausente. Sin embargo, la generación de plasma aumentó marginalmente. El paciente con actividad del Factor V del 44% mostró una reducción en la generación de trombinas con un tiempo de retraso prolongado y una disminución en la altura máxima, mientras que la generación plasmática se mantuvo dentro del rango normal.

En la deficiencia de Alfa-2-antiplasmina, la generación de plasma aumentó con la disminución de la actividad de la Alfa-2-antiplasmina. El paciente homocigoto con un 23% de actividad mostró un inicio temprano de la generación de plasmina, un tiempo de lisis de fibrina más corto y un pico plasmático más alto. Estas alteraciones también se observaron en el paciente heterocigoto con un 73% de actividad, aunque no eran tan pronunciadas.

El ensayo de hemostasis es muy adecuado para la investigación sobre deficiencias raras de factores de coagulación, trastornos fibrinolíticos y efectos hemostáticos de fármacos. Los principales retos son la estandarización de la técnica y la normalización de los resultados para mejorar la comparabilidad entre salas y laboratorios. Los trabajos futuros podrían centrarse en automatizar el ensayo y desarrollar adaptaciones para la compatibilidad con sangre total o plasma rico en placas.