Ensayo de formación de colonias que detecta la capacidad proliferativa de células de osteosarcoma por knockdown de ARNCn

Mi investigación se centra en el osteosarcoma y pretende analizar cómo la reducción de ARNlnc influye en la capacidad proliferativa a largo plazo mediante ensayos de información de colonias. Para empezar, sembra 5 por 10 a la potencia de 5 células de osteosarcoma 143B en dos platos de cultivo de 10 centímetros. Cultivar las células en DMEM completo suplementadas con suero fetal al 10% a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.

Prepara los reactivos de transfección 24 horas después, incluyendo plásmidos, polietilenimina y el medio esencial OptiMinium. Haz vórtices a cada reactivo y deja que se equilibren a temperatura ambiente antes de usarlos. Ahora, etiqueta cuatro tubos microcentrífugas de 1,5 mililitros para plásmidos y polietilenimina usando un rotulador.

Pipete 500 microlitros de medio esencial OptiMinium a cada tubo. Luego añade 10 microgramos de plásmido al tubo plásmido correspondiente y pipote 30 microlitros de polietilenimina en cada tubo. Mezcla cada tubo suavemente pipeteando arriba y abajo e incuba.

Ahora combina cada tubo de plásmido con su correspondiente tubo de polietilenimina. Mezcla suavemente y deja incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Aspira suavemente el medio de cultivo de los platos que contienen las células 143B.

Añade siete mililitros de medio sin suero a cada plato y etiqueta los platos según el plásmido a añadir. Añade la mezcla de transfección preparada en gota al recipiente de cultivo correspondiente. Añade la mezcla lentamente en un movimiento circular desde el borde exterior hacia el centro del plato.

Incuba las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Descarta el sobrenadante entre 8 y 12 horas después. Luego añade 10 mililitros de DMEM completo al plato de cultivo y incuba.

Observa las células bajo un microscopio de fluorescencia 72 horas después de cambiar el medio, retira el medio de los platos de cultivo. Añade 1,5 mililitros de ácido tripsina-EDTA para digerir las células. Las células pipetean suavemente para desprenderlas.

Luego añade cinco mililitros de medio completo para terminar la digestión. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo microcentrífuga de 15 mililitros. Luego se pipetean 20 microlitros de la suspensión celular en un hemocitómetro para contar las células.

Recoge 3 veces 10 a la potencia de 5 células para extraer ácido ribonucleico y verificar la eficiencia de derribamiento. Ahora sembra 2 por 10 a la potencia de 3 celdas por pozo en una placa de seis pozos. Pipeta completa el DMEM hasta un volumen final de dos mililitros.

Cultiva las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Monitoriza la formación de las colonias a diario. Terminar el cultivo cuando la mayoría de las colonias del grupo control contengan al menos 50 células o después de 10 a 14 días de incubación.

Después de descartar el sobrenadante, lava las células dos veces con un mililitro de PBS por pozo, descartando la solución tras cada lavado. Fija las células en un mililitro de solución al 10% de formalina durante 15 minutos. Descarta el fijador y luego lava las células dos veces con un mililitro por pozo de PBS.

Teñe las células con un mililitro de solución de violeta cristalina al 0,5% durante 10 a 30 minutos. Luego lava suavemente el plato con agua del grifo que corre lentamente. Seca las celdas al aire a temperatura ambiente.

Captura imágenes de las colonias usando una cámara. La eficiencia de transfección de células 143B fue confirmada por microscopía de fluorescencia 72 horas después de la transfección, lo que indica una entrega de plásmidos eficiente en ambas condiciones. El análisis de reacción RT-qPCR mostró que la expresión de SNHG6 se redujo significativamente en 143 células B transfectadas con shSNHG6 en comparación con el grupo shNC.

Los ensayos de formación de colonias revelaron una reducción significativa en el número y tamaño de colonias en el grupo knockdown SNHG6 en comparación con el grupo control. Este protocolo evalúa la proliferación a largo plazo de células individuales, proporcionando una mayor relevancia biológica y resultados más definitivos que los ensayos de proliferación metabólicos a corto plazo. Estudios futuros ampliarán este protocolo a más ARNnc y modelos tumorales para explorar sistemáticamente los mecanismos que regulan el potencial proliferativo de las células cancerosas.