Imagen espectroscópica de superresolución de moléculas de ADN usando contraste intrínseco

Nuestra investigación presenta el primer protocolo para medir espectros fluorescentes intrínsecos de moléculas de ADN, permitiendo investigar sus propiedades ópticas nativas y las características relacionadas con la confirmación de secuencias. Este protocolo aprovecha la fluorescencia endógena para la imagen espectroscópica de ADN, evitando la interrupción inducida por marcaje, el error de enlace y la densidad de marcado inconsistente en los métodos existentes. Para empezar, disuelve la muestra de ADN en agua desionizada libre de nucleasas hasta una concentración final de 100 milimolares.

Prepara alícuotas de cinco microlitros de la solución de ADN para minimizar los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Guarda los tubos extra que contienen la solución original a 4 grados Celsius. Con una toallita de laboratorio, limpia suavemente una lámina de vidrio.

Pipete cinco microlitros de la solución de ADN de 100 milimolares sobre el portaobjetos de vidrio recién limpiado y deja secar la muestra durante una a tres horas para formar un gel de ADN. En una campana extractora, preparar el tampón beta-mercaptoetanol o el tampón de imagen DABCO para soportar la fotoconmutación estocástica de moléculas de ADN. Pipetear cinco microlitros del tampón de imagen sobre el gel de ADN y colocar una capa de cubierta encima de la muestra.

Si hay burbujas dentro de la muestra cubierta, usa una pinza para eliminarlas. Obtener una matriz de nanohuecos fabricada que contenga agujeros de 100 nanómetros de diámetro, separados por cuatro micrómetros, dispuestos en ocho filas y cinco columnas. Enciende el sistema sSMLM e inserta filtros de ancho de banda estrecho justo delante de la cámara.

Coloca la muestra de calibración bajo un microscopio y enciende la lámpara del microscopio para iluminar la muestra. Ajusta el tiempo de exposición a 200 milisegundos para todos los filtros, pero cámbialo a 2.000 milisegundos para el filtro de 750 nanómetros. Ve a adquirir un rápido lapso de tiempo para ajustar el número de fotogramas a 10 para cada filtro.

Tras la calibración, carga la muestra de gel de ADN en el escenario del microscopio con el lado deslizante de la cubierta mirando hacia el objetivo y abre el software de la cámara para la adquisición de datos. Identifica la posición Z adecuada usando el sistema automático de seguimiento de enfoque y ajusta el enfoque hasta que se vea un parpadeo estocástico claro. Asegúrate de que el objetivo no toque el borde de deslizamiento de la tapa para evitar fugas de amortiguador en el aceite de inmersión e interferencias con el rastreo.

Adquiere entre 10.000 y 30.000 fotogramas con la potencia de iluminación deseada y un tiempo de exposición de 30 milisegundos. Tras la adquisición de datos, permite que el software guarde los datos en formato nd2 por defecto. Desecha la lámina de cristal en un contenedor de basura autorizado designado para cristales rotos o objetos punzantes.

Desecha todos los tampones restantes en el contenedor de residuos líquidos químicos designado según las directrices de seguridad institucionales. Abre Fiji y usa el plugin de bioformatos para cargar la pila de imágenes en bruto adquirida de la muestra de ADN. Selecciona la imagen seguida de pilas, Z Project, y elige la intensidad mínima como tipo de proyección para generar la proyección mínima de la pila de imágenes en bruto.

Selecciona la calculadora de imagen y resta la proyección mínima de la pila de imágenes en bruto. Guarda el conjunto de datos restado en segundo plano como archivo TIF para análisis espectral. A continuación, realiza la identificación de localización en la pila de imágenes raw de orden cero usando el plugin ThunderSTORM versión 1.3.

Fija el umbral a 1,2 veces la onda de desviación estándar. F1, ajustando el radio a tres, y sigma a 1,5 para reconstruir la imagen de orden cero y extraer las coordenadas del evento de emisión. Para la pila de imágenes raw de orden cero recortadas, selecciona el plugin seguido de ThunderSTORM y ejecuta el análisis.

Utiliza Fiji y el software de código abierto RainbowSTORM con MATLAB versión más reciente que 2020b para procesar los datos de calibración y obtener la relación entre los desplazamientos horizontales y verticales y las longitudes de onda. Realiza la identificación de localización en las imágenes de calibración de las cinco longitudes de onda usando el plugin ThunderSTORM. Fija el umbral a cinco veces la desviación estándar de la onda.

F1, ajustando el radio a tres, y sigma a 1,5 para reconstruir localizaciones de nanohuecos en el orden cero y las correspondientes localizaciones espectrales en el primer orden. Obtén una imagen media de cada dato de calibración y ajusta el umbral dentro de un rango de cinco a diez veces la onda de desviación estándar. Se obtienen localizaciones F1 hasta 80 para cada imagen de calibración.

Ejecuta RainbowSTORM y haz clic en explorar en calibración espectral para cargar los archivos CSV de cada longitud de onda de calibración. Luego haz clic en guardar archivo de calibración para guardar el archivo de calibración. Utiliza un script personalizado de Python versión 3.11.7 para extraer los datos de espectro completo.

Luego establece las rutas correctas de archivo en el script de Python para la pila de imágenes subtraídas en el formato TIF del paso anterior de resta de fondo. Establezca la ruta del archivo para el archivo CSV de localización producido a partir del paso de análisis de localización y el archivo de calibración en formato MAT generado a partir del paso de calibración. Luego se ajusta el desplazamiento horizontal a 925 a 984 píxeles para los datos de 532 nanómetros adquiridos con una DWP 3D correspondiente a una ventana espectral de 525 a 750 nanómetros para asegurar una cobertura más allá del rango de filtro de 590 a 650 nanómetros.

Ajusta el desplazamiento vertical a 23 píxeles tanto para los datos de 488 nanómetros como de 532 nanómetros adquiridos con el DWP 3D basándose en la curva de calibración espectral obtenida con RainbowSTORM. Finalmente, linealizar el espectro no lineal usando un ajuste polinómico de tercer orden para análisis de comparación y clasificación posteriores. Se realizó la calibración espectral, permitiendo medir los desplazamientos de píxeles horizontales y verticales correspondientes entre las imágenes de orden cero y primero.

Esto permitía asignar una curva de calibración entre la posición del píxel y la longitud de onda. Los espectros de emisión no lineal y el de emisión lineal convertidos bajo excitación de 532 nanómetros se obtuvieron para el alter GC, que se refiere a un tipo de molécula de ADN de doble hebra. La curva verde representaba el espectro medio.

Los espectros de emisión no lineales y lineales convertidos de A10C10, un tipo de molécula de ADN monocatenario, se obtuvieron bajo excitación de 488 nanómetros con la curva azul representando el espectro medio. Este protocolo permite a los investigadores medir espectros fluorescentes intrínsecos de moléculas de ADN sintéticas de cadena simple y doble mediante imágenes espectroscópicas de superresolución. Localizar con precisión la posición Z correcta es fundamental, ya que las muestras de gel de ADN carecen de información estructural y requieren una concentración cuidadosa para observar los parpadeos estocásticos.

Trabajos futuros pueden extenderse a medir la fluorescencia intrínseca del ARN y la proteína, integrando modelos computacionales para la predicción de secuencias e imagen por cromatina libre de marcas.