In Vitro Análisis funcional de células T reguladoras: enfoque en la proliferación y diferenciación

Nuestro laboratorio estudió la diferenciación de subconjuntos T, metabolismo e interacción. El Treg afecta la diafonía de las células T y mantiene la homeostasis inmune, lo que hace que la investigación del Treg sea crucial para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Los ensayos tradicionales de supresión de Treg in vitro pasaron por alto los efectos mediados por Treg y la diferenciación de las células T efectoras.

Este protocolo modificado evalúa simultáneamente tanto la proliferación como la polarización. Para empezar, preparar células T naïf, células reguladoras enriquecidas con T o Treg, y células no CD4 positivas enriquecidas con antígenos. Centrifugar la suspensión de células T CD4-positivas a 350G durante siete minutos a cuatro grados Celsius y descartar el sobrenadante para obtener la cápsula celular.

Diluye el tinte de proliferación celular eFluor 450 en PBS para obtener una concentración de 20 micromolares a temperatura ambiente. Añade 0,5 mililitros de PBS por uno por 10 a la potencia de siete celdas al tubo. Mantén el tubo inclinado aproximadamente a 45 grados y vuelve a suspender suavemente las células pipeteando 50 veces.

A continuación, añade rápidamente un volumen igual de la solución de colorante de proliferación celular en la suspensión celular para obtener una concentración final de 10 micromolares. Sujeta el tubo en un ángulo de 45 grados y pipeta las células para mezclarlas bien con el tinte de proliferación celular. Envuelve inmediatamente el tubo de la centrífuga con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.

Incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos mientras las vas vórtice suavemente cada cinco minutos para evitar la agregación celular. A continuación, añade 10 mililitros de medio de cultivo celular preenfriado al tubo de la centrífuga y gira suavemente las células para terminar la tinción. Luego centrifuga las celdas y descarta el sobrenadante.

Para lavar las células, añade cinco mililitros de medio de cultivo celular preenfriado al pellet celular. Repite la centrifugación y vuelve a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo. Tras el recuento de células, centrifugar las células y volver a suspender en un volumen adecuado de medio de cultivo para alcanzar una concentración celular de dos veces 10 a la potencia de seis celdas por mililitro.

Mantén el tubo en hielo. Calcula el número de muestras necesarias para el cultivo celular. Prepara una cantidad adecuada de medio de cultivo celular que contenga 2,5 microgramos por mililitro de anticuerpo anti-ratón CD3 o las citocinas de inducción adecuadas.

Toma células T ingenuas preparadas y células enriquecidas con Treg y hazlas en un vórtice. Añadir 100 microlitros de células T naïves positivas en CD45.2 y CD4 positivas y 100 microlitros de células no CD4 positivas enriquecidas con APC positivas en CD45.1 a la placa de 48 pozos. Transfiera 100 microlitros de células enriquecidas con Treg CD45.1 positivo, CD4 positivo y CD25 positivo a los pozos experimentales y 100 microlitros de medio de cultivo celular a los pozos de control.

Luego se pipetean 100 microlitros de medio de cultivo que contiene anticuerpo anti-ratón CD3 y 100 microlitros de medio de cultivo que contienen las citocinas de inducción adecuadas en cada pozo. Añade PBS a los pozos vacíos restantes para mantener la humedad de la placa y reducir los efectos de borde. Incubar la placa de 48 pozos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante tres días.

Pipete suavemente las células cultivadas para resuspenderlas y transfiere la suspensión a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifuga las células y elimina el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de medio de cultivo celular que contiene forbol 12-miristato 13-acetato, ionomicina y inhibidor de transporte proteico GolgiPlug a cada tubo.

Haz un vórtice suave para resuspender las células e incubarlas en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante tres horas. Tras la centrifugación, añadir 50 microlitros de PBS que contenga una prueba de tinte amarillo zombi y 1:100 de anticuerpos anti-ratón diluidos CD16 o 32 al comprimido. Haz un vórtice de las muestras e incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos para marcar las células muertas y bloquear los receptores de FC.

Centrifuga las celdas antes de desechar el sobrenadante. Añade 50 microlitros de cóctel de anticuerpos superficiales a la muestra, haz un vórtice y incuba a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 20 minutos. Luego se añade un mililitro de tampón de celda activado por fluorescencia o FACS a cada tubo de centrífuga.

Tras la centrifugación y la extracción del sobrenadante, se añaden 300 microlitros de solución de fijación y permeabilización a cada tubo de la centrífuga y se vórtican las muestras. Incubar las muestras a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 20 minutos. Transfiere mililitros de permeabilización y lavado de tampón a cada tubo de centrífuga, seguido de centrifugación y eliminación de sobrenadante.

Tras repetir el lavado, añade 50 microlitros de cóctel de anticuerpos de citocinas a cada muestra y haz un vórtice en las muestras. Incuba las muestras a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 40 minutos. Lava cada muestra con un mililitro de permeabilización y lava el tampón.

Centrifuga las células y elimina el sobrenadante. Resuspende el pellet celular en 300 microlitros de tampón FACS. Mide la proliferación y diferenciación de las células T respondedoras mediante citometría de flujo.

Limita la población de linfocitos entre las células totales para excluir los residuos celulares e impurezas. Selecciona la población unicelular entre los linfocitos basándose en señales de dispersión. Luego identifica la población de células vivas entre las células individuales, seguida de la población de células T CD4 positivas entre las células vivas.

A continuación, se trata de la población enriquecida con células T reguladoras CD45.1 positivas y de la población de células T efectoras CD45.2 positivas entre las células T CD4 positivas. Luego selecciona las células lagunentes T 1 positivas para interferón CD4 positivo en CD45.2, las células lagunentes T positivas en CD44 positivas en CD45.2 positivas para CD4 17, y las células T CD4 positivas no proliferadas en CD45.2 positivas entre las células T positivas en CD45.2. Realizar la adquisición de datos de citometría de flujo para todas las muestras.

Finalmente, analizar los datos de citometría de flujo con el software FlowJo utilizando la misma estrategia de gating que en la adquisición de datos de citometría de flujo. La frecuencia de células T respondedoras no proliferadas aumentó significativamente bajo condiciones de inducción tanto de T helper 1 como de T helper 17 tras co-cultivo con células T enriquecidas con células T reguladoras. La diferenciación de las células T helper 1 positivas para CD45.2 y CD4 positivas para interferón y T helper 1 positivas se suprimió significativamente tras el cocultivo con células T enriquecidas con reguladoras.

La frecuencia de células auxiliares positivas en CD45,2 y CD4 positivas en interleucina-17A positivas en 17 aumentó cuando las células T respondedoras se cultivaron con células enriquecidas con células T reguladoras. El análisis funcional in vitro de células Treg permite investigar los efectos biodireccionales entre las células Treg y las células T efectoras sobre la proliferación y polarización. El mayor desafío al realizar este protocolo es cómo mantener la viabilidad celular asegurando la pureza de las células Treg y las células T ingenuas.

Tras este proceso, ELISA y otros ensayos biomédicos pueden evaluar la producción de citocinas y efectores metabólicos, mientras que las células clasificadas por FACS permiten análisis posteriores de RNA-seq y proteómica.