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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Básica y Aplicada de Investigación de Guangdong (2023A1515011278), el Proyecto Autogestionado del Instituto de Investigación de Biotecnología de la Provincia de Guangdong (GDBRI-ZL202602) y el Intercambio y Cooperación Académica China-Canadá sobre Modelos y Patogénesis de Enfermedades Cardiovasculares (MS202500058).

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. H., Houle, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+for+a+common+standard+for+2D+speckle+tracking+echocardiography:+consensus+document+of+the+EACVI/ASE/Industry+Task+Force+to+standardize+deformation+imaging.">Definitions for a common standard for 2D speckle tracking echocardiography: consensus document of the EACVI/ASE/Industry Task Force to standardize deformation imaging.</a> J Am Soc Echocardiogr. 28 (2), 183-193 (2015).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), (2014).</li><li>Gao, E., Lei, Y. H., Shang, X., Huang, Z. M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

En este estudio, generamos un ratón deficientes en Cracd modificado mediante CRISPR/Cas9 y establecimos un protocolo para fenotiparlo tras el IM mediante ecocardiografía convencional, imagen de deformación por seguimiento de puntos y histología. El protocolo produjo animales knockout con pérdida confirmada de la proteína CRACD. Los ratones deficientes en Cracd mostraron menos dilatación ventricular, mejor FE y fibrosis reducida en comparación con los controles WT tras el IM, lo que confirma la utilidad del modelo para estudiar la remodelación cardíaca.
El éxito de este modelo depende de varios pasos críticos. El diseño de la gRNA y su validación in vitro afectan directamente la eficiencia de la edición en cigotos23. Utilizamos CRISPick o Benchling para seleccionar gRNAs con puntuaciones CRISPRater ≥ 0.5 y luego probamos la eficiencia de corte mediante un ensayo in vitro de Cas9/gRNA. Solo se microinyectan las gRNAs que logran un corte &#62; 50%. La ligadura adecuada de la ADA también es igualmente crucial: la sutura 7‑0 debe pasar a 2–3 mm del origen de la ADA y a una profundidad de 0,5–1 mm para evitar perforar el ventrículo derecho (demasiado profundo) o no lograr la oclusión del vaso (demasiado superficial); el blanqueamiento inmediato de la pared anterior confirma la oclusión. El control de la frecuencia cardíaca durante la ecocardiografía también es esencial24; mantenerla entre 450 y 550 lpm mediante el ajuste de isoflurano (típicamente 1–2%) mejora la reproducibilidad de las mediciones convencionales y de deformación. Finalmente, para el análisis de seguimiento de puntos, la evaluación visual de la malla codificada por colores es fundamental25. La malla debe seguir los bordes miocárdicos sin movimientos bruscos; de lo contrario, se requiere ajuste manual; si la calidad sigue siendo deficiente tras tres intentos, el ratón se excluye.
Aunque se siga el protocolo minuciosamente, pueden surgir ciertas dificultades técnicas. La resolución sistemática de problemas puede solucionar la mayoría de ellas. Tasas bajas de transmisión germinativa (inferiores al 10 %) suelen indicar una integración deficiente del oligonucleótido donador o una actividad débil del ARN guía26. En consecuencia, aumentar el oligo donador a 20 ng/µL, extender los brazos de homología a 120–200 pb y volver a verificar el corte del ARN guía (&#62; 50 %) puede mejorar la transmisión. Una mortalidad elevada tras el IM (superior al 30 %) suele deberse a neumotórax, hemorragia o una infartación extensa27. Por tanto, mantener a los ratones con oxígeno continuo hasta que despierten y utilizar una almohadilla térmica para conservar la temperatura corporal reduce notablemente las tasas de mortalidad. Si la pared anterior no se vuelve pálida tras la ligadura, probablemente se haya identificado incorrectamente la ADA o la sutura sea demasiado superficial. En este caso, localizar nuevamente la ADA (un vaso diagonal de color rojo brillante) y volver a pasar la aguja a una profundidad de 0,5–1 mm, a veces con un microscopio de disección, resuelve este problema. En caso de baja calidad en el seguimiento de puntos, las causas habituales son una baja tasa de cuadros, bordes borrosos o artefactos por movimiento28. Por consiguiente, aumentar la tasa de cuadros, ajustar finamente la ganancia, corregir manualmente el trazado endocárdico y descartar ciclos con arritmias ayuda a mejorar los resultados.
Más allá de estas consideraciones operativas, el método tiene limitaciones evidentes. La eliminación de Cracd es global, por lo que CRACD falta en todos los tejidos. En consecuencia, la protección observada no puede atribuirse exclusivamente a los cardiomiocitos, ya que las contribuciones sistémicas también podrían desempeñar un papel. Sería necesario un knockout condicional para separar funciones específicas según el tipo celular. Otra limitación es el único punto temporal en el día 7; no se observa nada sobre el remodelado crónico. Por lo tanto, deberían añadirse puntos temporales posteriores (4 u 8 semanas) para estudios a largo plazo. La reproducibilidad también se ve afectada por la dependencia de la calidad de la imagen: no todos los sistemas de ultrasonido pueden obtener bordes endocárdicos nítidos, y la experiencia del operador es importante. Por ello, se recomienda que una persona profesionalmente capacitada realice todas las cirugías y mediciones.
Dadas estas limitaciones, es útil comparar nuestro enfoque con estrategias alternativas para estudiar la función génica en la remodelación post-infarto de miocardio. La manipulación génica mediada por AAV y los oligonucleótidos antisentido (ASOs) son dos alternativas comunes29,30. El AAV9 puede lograr una sobreexpresión o silenciamiento transitorio y específico del corazón sin necesidad de cruces genéticos, pero sus limitaciones incluyen el tamaño máximo de empaquetamiento (~4,7 kb), eficiencia de transducción variable y efectos fuera del blanco, lo que constituye una desventaja31. En contraste, nuestro modelo de knockout mediante CRISPR/Cas9 ofrece una pérdida permanente y completa de función, lo cual es ventajoso para estudios a largo plazo. Los ASOs permiten un silenciamiento reversible y dependiente de la dosis con inicio rápido, lo que los hace adecuados para intervenciones agudas; sin embargo, requieren administración repetida y carecen de especificidad tisular32. Por lo tanto, el knockout constitutivo descrito aquí es el más indicado para el descubrimiento inicial y la fenotipificación crónica.
Finalmente, el protocolo puede extenderse más allá del CRACD. El mismo flujo de trabajo —la generación mediante CRISPR/Cas9 de ratones knockout combinada con ecocardiografía, imágenes de deformación y histología— puede evaluar cualquier gen candidato en la remodelación post-infarto de miocardio. El marco de fenotipado también se adapta a otros modelos de enfermedades cardiovasculares, como la constricción aórtica transversa (sobrecarga de presión) o la lesión por isquemia-reperfusión. Además, las muestras de tejido obtenidas mediante este protocolo pueden utilizarse para análisis multi-ómicos (transcriptómica, proteómica, metabolómica) con el fin de descubrir mecanismos moleculares. El modelo deficiente en Cracd puede servir como herramienta para pruebas de fármacos: se pueden evaluar compuestos cuya acción se sospecha que ocurre a través de la vía CRACD. Así, este protocolo proporciona una plataforma adaptable a una amplia gama de estudios mecanicistas y traslacionales en la investigación cardiovascular.

El infarto de miocardio (IM) sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que representa una carga significativa para la salud cardiovascular global.1El pronóstico a largo plazo tras un infarto de miocardio está determinado principalmente por el proceso de remodelación del ventrículo izquierdo (VI).2, que implica dilatación ventricular, adelgazamiento de la pared y fibrosis intersticial3,4, que son factores clave en la progresión hacia la insuficiencia cardíaca (IC). La incidencia global de IC derivada del remodelado cardíaco post-infarto de miocardio agrava aún más la carga de la enfermedad cardiovascular5A pesar de estas observaciones clínicas bien establecidas, faltan estudios sistemáticos que utilicen modelos in vivo sensibles y reproducibles para evaluar el papel de genes específicos en la remodelación post-infarto de miocardio. Actualmente no existe ningún protocolo que combine un modelo de knockout modificado con CRISPR/Cas9 con imágenes avanzadas de deformación para evaluar un regulador del citoesqueleto como CRACD. Por lo tanto, se necesita urgentemente un método que permita una manipulación genética precisa y un fenotipado cardíaco de alta resolución.
El regulador de la dinámica de actina que inhibe la proteína de cierre (CRACD), también conocido como KIAA1211, es un regulador de la polimerización de actina predominantemente localizado en el citosol que desempeña un papel fundamental en la dinámica del citoesqueleto6. Regula positivamente la polimerización de actina al unirse a las proteínas de cierre de actina (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) e impedir que se unan a los extremos punta de los filamentos de actina7. En los tejidos epiteliales, CRACD desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la morfología celular y la transducción de señales al preservar la integridad del citoesqueleto de actina8,9. En células tumorales, su desregulación se asocia con una mayor metástasis y proliferación celular6,10. El papel de CRACD en el corazón aún no se comprende completamente. Estudios sobre el transcriptoma cardíaco y de intervención experimental muestran que la expresión del gen Cracd responde al estrés patológico y podría regular genes relacionados con la dinámica del citoesqueleto durante la remodelación ventricular9,11. Además, su proteína inhibidora CapZ ha estado estrechamente relacionada con la patología cardíaca: la fosforilación de CapZ regula el crecimiento de los miofibrillas durante la hipertrofia inducida por fenilefrina12. Nuestra investigación previa indica que una leve disminución de CRACD confiere protección contra el daño miocárdico y preserva la contractilidad del mionofilamento tras una isquemia aguda13. Estos hallazgos sugieren la posibilidad de que CRACD desempeñe un papel en la remodelación ventricular maladaptativa tras un infarto de miocardio (MI). Sin embargo, han faltado estudios sistemáticos in vivo de pérdida de función que prueben si la deficiencia de Cracd modula la remodelación post-MI, principalmente debido a la ausencia de un protocolo validado paso a paso para generar y fenotipar un ratón deficiente en Cracd bajo estrés isquémico.
Existen varios enfoques para generar ratones knockout constitutivos. La recombinación homóloga tradicional en células madre embrionarias (ES) es precisa, pero costosa, lenta (12–18 meses) y limitada a ciertas cepas de ratón14. La mutagénesis con ENU (N-etil-N-nitrosourea) produce mutaciones puntuales aleatorias que requieren retrocruzamientos y secuenciación extensos15. En contraste, CRISPR/Cas9 ofrece ventajas prácticas distintas para este estudio: (i) la inyección directa en cigotos acorta el tiempo a 4–6 meses; (ii) permite la eliminación de un fragmento genómico grande (3153 pb) para asegurar la pérdida completa de función; (iii) funciona directamente sobre el fondo genético C57BL/6N sin necesidad de conversión de cepa; y (iv) evita el uso de un marcador seleccionable, minimizando interferencias transcripcionales no deseadas. Por lo tanto, CRISPR/Cas9 es la opción más eficiente para generar una línea deficiente en Cracd adecuada para fenotipado cardiovascular de rutina. Esta tecnología se ha utilizado ampliamente para realizar estudios precisos in vivo de pérdida de función16,17.
La imagen de deformación mediante seguimiento de moteado es una técnica de posprocesamiento que sigue el movimiento de los moteados acústicos naturales dentro del miocardio cuadro por cuadro, lo que permite el cálculo de parámetros de deformación miocárdica como la deformación (cambio fraccional en longitud) y la velocidad de deformación (tasa de deformación)18. A diferencia de la ecocardiografía en modo M convencional o bidimensional, que proporciona índices funcionales globales (fracción de eyección, acortamiento fraccional, diámetro interno del ventrículo izquierdo) y es relativamente insensible a las anomalías regionales del movimiento de la pared, la imagen de deformación puede cuantificar la función contráctil segmentaria. Esto es particularmente importante en el período temprano posterinfarto, donde la hipercinesia compensatoria de los segmentos no infartados puede preservar la fracción de eyección global a pesar de una disfunción regional significativa. El seguimiento de moteado ofrece varias ventajas sobre los puntos finales estándar: proporciona valores segmentarios de deformación y velocidad de deformación, desplazamiento y velocidad, detectando así cambios subclínicos sutiles19; puede identificar la disincronía y los déficits contráctiles iniciales antes de que ocurra la remodelación irreversible; y examina directamente la subendocardio, la capa más vulnerable a la isquemia20. En este estudio, CRACD es un regulador del citoesqueleto que podría influir en la contractilidad de las miofibras a nivel microscópico. Las mediciones convencionales basadas en la cavidad podrían pasar fácilmente por alto tales efectos mecánicos locales. Por lo tanto, la integración del análisis mediante seguimiento de moteado en este protocolo mejora la capacidad de detectar los efectos protectores tempranos de la deficiencia de Cracd. En consecuencia, integrar el seguimiento de moteado en este protocolo proporciona una herramienta sensible y cuantitativa para evaluar la remodelación posterinfarto, especialmente durante la primera semana tras el infarto de miocardio, cuando emergen la dilatación temprana y la disfunción contráctil21,22.
Este protocolo está diseñado para investigadores que estudian el impacto funcional de una deleción génica específica en la remodelación aguda (7 días) posterior al IAM, utilizando una combinación de ratones knockout constitutivos y técnicas de imagen de alta resolución. Es apropiado para estudios generadores de hipótesis en los que se acepte la pérdida global del gen diana y el punto final principal sea la evaluación de la función sistólica temprana y los cambios estructurales. Sin embargo, deben considerarse varias limitaciones. Primero, el ratón deficiente en Cracd es un knockout global; por lo tanto, los efectos cardioprotectores observados no pueden atribuirse exclusivamente a la pérdida de CRACD en los cardiomiocitos, ya que las contribuciones sistémicas también podrían desempeñar un papel. Serán necesarios estudios futuros que utilicen estrategias de knockout condicional para lograr una deleción específica del corazón. Segundo, el protocolo se centra en un único punto temporal (día 7) y no aborda la remodelación crónica ni la progresión de la IC. Serán necesarios estudios longitudinales más allá de la fase aguda. Tercero, el análisis mediante seguimiento de puntos (speckle-tracking) requiere imágenes de alta calidad (bordes endocárdicos bien definidos) y software especializado, que puede no estar disponible en todas las instalaciones centrales. A pesar de estas limitaciones, el protocolo proporciona una plataforma robusta y reproducible para la caracterización funcional inicial de genes implicados en la remodelación cardíaca post-IAM.
Este estudio tuvo como objetivo utilizar el sistema CRISPR/Cas9 para generar y validar un modelo murino deficiente en Cracd (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 a c.3352+255 del)) con el fin de investigar el impacto de la deficiencia de Cracd en el remodelado cardíaco post-infarto de miocardio (IM) y en el movimiento de la pared ventricular. Se indujo un infarto de miocardio (IM) tanto en ratones de tipo silvestre (WT, C57BL/6N) como en ratones deficientes en Cracd, y se realizaron evaluaciones exhaustivas una semana después del IM. Las evaluaciones incluyeron parámetros ecocardiográficos convencionales, análisis de deformación por seguimiento de puntos (speckle-tracking), y evaluación histopatológica. Nos enfocamos específicamente en la fase temprana posterior al IM (día 7) para captar los eventos iniciales de remodelado y determinar si la deficiencia de Cracd afecta la dilatación ventricular y la función sistólica durante la fase aguda del IM. Se espera que los hallazgos proporcionen información valiosa sobre el papel de CRACD en la modulación del remodelado cardíaco adverso tras un infarto de miocardio.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>Utilizada para preparar el tampón de extracción de ADN</td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Utilizada para la digestión de cola de ratón</td></tr><tr><td>Mezcla Green Taq</td><td>Vazyme, China</td><td>P131</td><td>Utilizada para la amplificación por PCR</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>BioFroxx, Alemania</td><td>1110GR500</td><td>Utilizada para electroforesis en gel de ADN a una concentración del 1&amp;ndash;2%</td></tr><tr><td>Marcador de ADN</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>Utilizado como escalera de ADN para determinar el tamaño de los productos de PCR</td></tr><tr><td>Kit TIANamp para ADN Genómico</td><td>Tiangen Biotech, China</td><td>DP304</td><td>Utilizado para extraer ADN genómico de tejido de cola de ratón</td></tr><tr><td>Kit de transcripción MEGAshortscript&amp;trade; T7</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>Utilizado para la transcripción in vitro de ARN-guía (gRNA)</td></tr><tr><td>Kit de purificación de ARN</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Utilizado para purificar el ARN-guía transcrito</td></tr><tr><td>Kit de detección de ARN-guía BeyoCRISPR&amp;trade;</td><td>Beyotime, China</td><td>D8412S</td><td>Utilizado para evaluar in vitro la actividad de corte del ARN-guía</td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>Utilizado para prevenir la degradación del ARN durante la transcripción in vitro</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japón</td><td>R001A</td><td>Utilizado para la genotipificación por PCR del ADN de cola de ratón</td></tr><tr><td>Medio de preincubación de espermatozoides FERTIUP&amp;reg; para ratón: PM</td><td>Cosmo Bio, Japón</td><td>KYD-002-EX</td><td>Utilizado para la capacitación de espermatozoides antes de la fertilización in vitro</td></tr><tr><td>Kit T7 ARCA para ARN mensajero</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Utilizado para la transcripción in vitro del ARN mensajero de Cas9</td></tr><tr><td>Gonadotropina de suero de yegua preñada</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Utilizada para la superovulación, administrada mediante inyección intraperitoneal</td></tr><tr><td>Gonadotropina coriónica humana</td><td>ProSpec, Israel</td><td>HOR-250</td><td>Utilizada para inducir la ovulación, administrada mediante inyección intraperitoneal</td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Aladdin, China</td><td>R665526</td><td>Utilizada para la disolución de ARN y el montaje de reacciones de PCR</td></tr><tr><td>Primeros</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>/</td><td>Utilizados para la genotipificación</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cirugía&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isóflurano</td><td>RWD Life Science, China</td><td>R510-22-10</td><td>Utilizado para la inducción y mantenimiento de la anestesia durante la cirugía</td></tr><tr><td>Cremas depilatorias</td><td>Veet, Francia</td><td>1000207</td><td>Aplicadas en la zona torácica para eliminar el vello antes de la cirugía y la ecografía</td></tr><tr><td>Sutura 7-0</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ7022380206</td><td>Utilizada para la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior (LAD)</td></tr><tr><td>Sutura 4-0</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ4022380412</td><td>Utilizada para cerrar la incisión cutánea tras la cirugía</td></tr><tr><td>Ventilador de anestesia</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>Utilizado para administrar isóflurano y apoyar la respiración</td></tr><tr><td>Ventilador para pequeños animales</td><td>Taimeng, China</td><td>HX-101E</td><td>Utilizado para proporcionar ventilación con presión positiva durante la cirugía a tórax abierto</td></tr><tr><td>Almohadilla calefactora de temperatura constante</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Utilizada para mantener la temperatura corporal del ratón durante la cirugía y la recuperación</td></tr><tr><td>Retractor de costillas</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>LN-18-4101</td><td>Utilizado para separar las costillas y exponer el corazón para la ligadura de la arteria LAD</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-0551</td><td>Utilizadas para realizar incisiones en la piel y cortar tejidos</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon, Japón</td><td>SMZ 745</td><td>Utilizado para obtener una vista ampliada durante la cirugía de ligadura de la arteria LAD</td></tr><tr><td>Portaagujas microscópico</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-2211</td><td>Utilizado para manipular la aguja de sutura 7-0 bajo el microscopio</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Productos químicos y reactivos&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agentes acoplantes ultrasónicos</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, China</td><td>TM-100</td><td>Aplicados en el tórax para ecocardiografía, garantizan un buen contacto del transductor</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Utilizado para la fijación del tejido cardíaco tras su extracción</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Macklin, China</td><td>1330-20-7</td><td>Utilizado para la eliminación de parafina y la clarificación del tejido antes de la tinción</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Tinción nuclear, utilizada en la tinción HE</td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Tinción citoplasmática, utilizada en la tinción HE</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Utilizado en la tinción de Masson para la tinción del citoplasma</td></tr><tr><td>Ácido fosfomolíbdico</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Utilizado en la tinción de Masson como mordiente y para diferenciación</td></tr><tr><td>Solución de azul de anilina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Utilizada en la tinción de Masson para la tinción de fibras de colágeno (azul)</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra CRACD</td><td>Absea, China</td><td>KC-35356</td><td>Anticuerpo primario para detectar la proteína CRACD mediante Western Blot, dilución 1:2000</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra GAPDH</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Anticuerpo de control de carga para Western Blot, dilución 1:5000</td></tr><tr><td>Etileno</td><td>Macklin, China</td><td>64-17-5</td><td>Utilizado para deshidratación y preparación de reactivos (grados 70%, 80%, 95%, 100%)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipos de laboratorio&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Utilizada para la preparación rutinaria de muestras</td></tr><tr><td>Ciclador térmico para PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>Utilizado para la amplificación de ADN</td></tr><tr><td>Sistema de microinyección</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td>5193000020</td><td>Utilizado para la microinyección de reactivos CRISPR/Cas9 en cigotos</td></tr><tr><td>Sistema de imagen Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Canadá</td><td>Vevo2100</td><td>Sistema de imagen de alta frecuencia para evaluación no invasiva de la función y estructura cardíaca tras el infarto de miocardio</td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Leica, Alemania</td><td>DM2500</td><td>Utilizado para observar secciones cardíacas teñidas con HE y Masson</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software de análisis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Utilizado para análisis de imágenes, incluyendo medición de áreas, cuantificación de señales y procesamiento de imágenes histológicas (tinción HE y Masson)</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Canadá</td><td>/</td><td>Software VevoLab para análisis de función cardíaca; módulo VevoStrain utilizado para análisis de deformación miocárdica para evaluar el rendimiento cardíaco tras el infarto de miocardio</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>Utilizado para análisis estadístico y preparación de gráficos</td></tr></tbody></table>

generación y caracterización fenotípica de un modelo murino deficiente en cracd modificado con crispr/cas9 para estudios de remodelación post-infarto de miocardio

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Este protocolo describe la generación y la caracterización fenotípica de un modelo de ratón C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mediante la tecnología CRISPR/Cas9 para estudiar el papel de CRACD en el remodelado cardíaco tras un infarto de miocardio.

Generación y Caracterización Fenotípica de un Modelo Murino Deficiente en Cracd Modificado con CRISPR/Cas9 para Estudios de Remodelación Post-Infarto de Miocardio

El infarto de miocardio (IM) sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Este protocolo describe un método para generar y caracterizar...

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

La insuficiencia cardíaca es la principal causa de hospitalización y una de las principales causas de mortalidad. Se aplica un modelo de ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones para investigar el remodelado ventricular y la disfunción cardíaca después del infarto de miocardio. Se presenta la técnica de mediciones hemodinámicas invasivas en ratones.

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Este artículo demuestra un modelo para estudiar la remodelación cardíaca después de la criolesión miocárdica en ratones.

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

Este protocolo presenta una manera simple y coherente de regular transitoriamente un gen de interés utilizando modRNA después del infarto de miocardio en ratones.

Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de...

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

Hay varias diferencias entre los ventrículos derecho e izquierdo. Sin embargo, no se ha aclarado la fisiopatología del infarto del ventrículo derecho (RVI). En el presente protocolo, se introduce un método reproducible para la generación de modelos de ratón RVI, que puede proporcionar un medio para explicar el mecanismo de RVI.

Generación y caracterización del infarto de miocardio del ventrículo derecho inducido por ligadura permanente de la arteria coronaria derecha en ratones

Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

Photothrombosis es una técnica rápida, mínimamente invasivo para la inducción de infarto pequeño y bien delimitado en áreas de interés de una manera altamente reproducible. Es especialmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.

Isquemia photothrombotic: Un modelo de lesión cortical fotoquímico mínimamente invasiva y reproducible de Estudios Carrera Ratón

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Generación y Caracterización Fenotípica de un Modelo Murino Deficiente en Cracd Modificado con CRISPR/Cas9 para Estudios de Remodelación Post-Infarto de Miocardio

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