Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Hola, soy Amish Matan y pertenezco al laboratorio del Dr. Sha Mc Barian en el departamento de psiquiatría de la Escuela de Medicina de UMass. Hoy les mostraré un procedimiento para la inmunoprecipitación de cromatina en tejido cerebral humano posmortem. Aunque el siguiente procedimiento no es muy complicado.

Lo más emocionante es que hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limitaban a la cuantificación simple de ARNm y proteínas. Esta técnica en particular nos dará una mejor comprensión de la base mecanicista de la expresión génica tanto en el cerebro humano normal como en el enfermo. Así que comencemos a inmunoprecipitar la cromatina.

Comenzamos con tejido cerebral humano postmortem previamente diseccionado y congelado. Es importante usar gafas de seguridad y trabajar en un área designada para manipular tejido humano. Al procesar estas muestras, el tejido cerebral se diluye con cinco veces el volumen del cerebro de tampón de sedimentación.

Una vez que todo el tejido parezca haberse vuelto homogéneo en la solución, podemos transferirlo a un tubo de dos mil. Después de que el tejido haya sido homogenizado, agregue cinco unidades por mil de nucleasa micrococal al ejemplo y mezcle la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, colóquelo en hielo.

Es importante realizar el paso rápidamente, ya que la micrococcal nuclease tiene la capacidad de actuar incluso a cuatro grados Celsius. Una vez que todas las muestras han sido tratadas con micrococcal nuclease, pasamos rápidamente al baño de agua a 37 grados Celsius e incubamos las muestras durante siete minutos.

Después de la incubación de siete minutos, agregamos EDTA 0,5 M hasta una concentración de 10 milimoles para detener la actividad de la micrococcal nuclease. Ahora estamos listos para pasar al paso de fragmentación. Después de tratar con micrococcal nuclease, nuestras muestras, que contienen el ADN nucleosomal, comenzarán la fragmentación.

Nava tomará un tubo Falcon de 15 ml al que añadiremos 4,5 ml de EDTA 0,2 milimolar, 2,5 microlitros de benzidina 0,2 molar y 4,5 micros de PMSF 0,1 molar a este tubo. Transferiremos nuestra muestra. Ahora incubaremos nuestra muestra durante una hora en hielo, agitándola en vórtex cada 10 minutos.

Al final de la incubación de una hora, añadiremos 2,5 microlitros de DTT tres molar. La muestra se mezcla nuevamente en vórtex y luego se centrifuga en un rotor de cabezal oscilante a 3.175 RCF durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, se distribuye el sobrenadante, utilizando 500 microlitros como control de entrada, que contendrá únicamente ADN genómico, y el resto se divide en dos tubos con 1.600 microlitros de muestra cada uno, que serán nuestras muestras de inmunoprecipitación de cromatina.

El control de entrada se coloca a menos 80 grados Celsius durante la noche hasta su uso posterior. A continuación, agregamos 160 microlitros de FSB 10X, una décima parte del volumen de nuestra muestra. Junto con ello, agregamos cuatro microgramos del anticuerpo.

Ahora vortex las muestras y luego rodéalas a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la incubación nocturna, lavaremos los giros de proteína que se utilizarán para aislar nuestro ADN nucleosomal. Dado que estas perlas de agarosa son muy sensibles, es necesario recortar las puntas de los extremos de las puntas de pipeta al trabajar con ellas.

Esto garantiza que las perlas tengan más espacio durante la pipetación. Ahora agregue 1,6 mils de una perla XFS a 245 microlitros de proteína jaguars en un tubo microcetrífugo de dos mil. Esto debería ser suficiente para cuatro tubos de muestra.

A continuación, separe la solución de perlas en dos tubos de dos mil y rellene cada uno hasta 1,6 mils con un XFSB. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 30 segundos en un rotador y luego centrifúgelos a 0,1 RCF durante 30 segundos. Tras la centrifugación, retire el ATE utilizando un vacío.

Añada 1,6 mils de un XFSB. Una vez más, rote las muestras durante 30 segundos en un rotador y luego centrifúguelas nuevamente a 0,1 RCF FS durante 30 segundos. Tras la centrifugación, eliminamos nuevamente el sobrenadante y combinamos ambos tubos con 1,5 mils de un XFSB.

Adicione también 15 microlitros de ADN de espermatozoides. Incube con rotación a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego centrifugue a 0,1 RCF durante 30 segundos. Retire el sobrenadante y agregue 200 microlitros de FBS 1X.

Ahora agregue 90 microlitros de agro speeds a cada muestra de precipitación de cromatina, y luego rote durante una hora a cuatro grados. Como control negativo, agregue un mililitro de FSB 1X al agro speeds restante y rote junto con la muestra de inmunoprecipitación de cromatina a cuatro grados Celsius durante una hora. Durante la incubación de una hora, podemos aprovechar para preparar un poco de tampón de resolución fresco.

Esto se utilizará más adelante en el experimento después de la incubación de una hora. Centrifugue las muestras y el control negativo a 0,1 CFS durante 30 segundos y deseche el sobrenadante. A continuación, lavaremos las perlas con cuatro tipos diferentes de soluciones de lavado: un tampón de lavado de baja salinidad, un tampón de lavado de alta salinidad, una solución de cloruro de litio y, finalmente, tampón TE a pH ocho.

Para cada tampón excepto la solución de cloruro de litio, rotaremos las muestras durante tres minutos a temperatura ambiente y luego las centrifugaremos a 0,1 R Cs durante 30 segundos. Para el lavado con cloruro de litio, gire las muestras a temperatura ambiente durante solo un minuto. Después de cada lavado, deseche el sobrenadante utilizando un vacío.

Ahora estamos listos para proceder a la elución de nuestras muestras. Para iniciar el paso de elución, agregamos 250 microlitros de tampón de elución recién preparado a cada muestra. Incubar las muestras en rotación durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugar a 0,4 RCF durante un minuto.

Ahora guarde el sobrenadante en un tubo naranja de dos mil. A continuación, agregue 250 microlitros de tampón de evolución a cada muestra. Una vez más, vortexee manualmente todas durante unos segundos.

Luego, agite las muestras en vórtex durante 15 minutos; tras agitar durante 15 minutos, centrifugue los tubos. Añada 16 RCF durante cuatro minutos y guarde el sobrenadante en el mismo tubo de 2 mililitros. Para digerir la proteína en nuestras muestras, primero añada 10 microlitros de A DTA 0,5 molar, 25 microlitros de HCl de twist 0,8 molar a un pH de 6,5 y 2,5 microlitros de proteinasa K de 10 miligramos por mililitro a cada muestra de inmunoprecipitación de cromatina.

Junto a cada control de entrada, agregue 15 microlitros de tampón de lisis y 2,5 microlitros de proteinasa K al 10 miligramos por ml. Incube ambas muestras, la de entrada y la de inmunoprecipitación de cromatina, a 52 grados Celsius durante al menos tres horas. Ahora que ha finalizado la incubación de tres horas, podemos continuar y comenzar la extracción con fenol cloroformo.

Después de la incubación de tres horas, agregamos 500 microlitros de fenil cloroformo a cada muestra. Esto se realiza en la campana extractora debido a que el fenil cloroformo es un compuesto orgánico que resulta dañino tanto por contacto con la piel como por inhalación. A continuación, vortexeamos todas las muestras durante varios segundos y las centrifugamos a 13 RCF durante cinco minutos tras la centrifugación.

Deben estar presentes dos fases dentro de los tubos. Dado que estamos interesados en el contenido de la fase superior, extraeremos esta fase y la colocaremos en un tubo microcentrífugo de dos mil. A continuación, se añade a cada muestra una mezcla de dos microlitros de glicógeno y 50 microlitros de acetato de sodio tres molar, junto con 1,375 mililitros de etanol al cien por cien.

Todas las muestras se agitan vigorosamente en vórtex y se colocan a menos 80 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación nocturna, las muestras se colocan sobre hielo para descongelar. Se centrifugan densamente a 15 RCF durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento en el fondo del tubo. A continuación, agregue un mililitro de etanol frío al 75 % a cada muestra e invierta los tubos cuatro a seis veces. Luego, se centrifugan nuevamente los tubos a 18 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Se elimina nuevamente el sobrenadante y se deja secar al aire los pellet. Una vez que los pellet están secos, se disuelven en 50 microlitros de HCl traza cuatro milimolar de pH ocho y se almacenan a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior. Bueno, acabo de mostrarle cómo realizar inmunoprecipitaciones de cromatina en tejido cerebral postmortem humano congelado.

Y recuerde, al realizar este procedimiento, es importante tomar todas las precauciones necesarias al trabajar con tejido cerebral humano; los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina pueden utilizarse para agregar una capa adicional de comprensión sobre la expresión génica tanto en el cerebro humano normal como en el enfermo. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.