Name: Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende la técnica de inmunoprecipitación de cromatina en tejido cerebral humano post mortem para estudiar metilación de histonas y reguladores epigenéticos. Este método permite comprender los mecanismos de expresión génica en cerebros normales y enfermos.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud Mental (5R01MH071476).

Procedimiento: 1 ª Jornada 1. Homogeneizar 50-500 mg de tejido congelado cuestión post-mortem gris con Douncing Buffer. ! PRECAUCIÓN - tejidos humanos deben ser manipulados con cuidado bajo condiciones de estricta seguridad. Se debe manipular a las normas de seguridad BSL-2 o superior. <ol><li> Tener previamente disecado, post-mortem de cerebros de los -80 ° C, los Dounce en el volumen cerebral de Buffer 5X Douncing, y el lugar en el tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Combinado de la muestra y el control de los pares se procesan simultáneamente. </li></ol> 2. Micrococcal nucleasa (MN) Digestión <ol><li> Añadir 5U/mL de micrococcal nucleasa de la muestra y la mezcla dentro de la solución con la pipeta de arriba a abajo antes de colocarlos en hielo. * Paso crítico - Es importante hacer este paso con rapidez ya que MN tiene la capacidad de actuar en hasta 4 ° C. </li><li> Incubar las muestras durante 7 minutos a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación de 7 minutos, añadir 0,5 M EDTA a una concentración de 10 mM para detener la actividad MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> Coloque las muestras en un tubo de 15 ml halcón. Añadir 10 veces el volumen de muestra de 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 del volumen de muestra de benzamidina 0,2 M y el volumen 1 / 1000 de la muestra de phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 M (PMSF). Estos dos últimos compuestos se utilizan como inhibidores de la proteasa. * Paso crítico - Es importante mantener las muestras en hielo durante todos estos pasos. </li><li> Incubar la muestra durante 1 hora, mientras agitación cada 10 minutos. </li><li> Al final de la incubación de una hora, agregar el volumen 1 / 2000 de la muestra de 3M TDT, un nuevo inhibidor de la proteasa. </li><li> Muestra Vortex, una vez más y se centrifuga a 3175 rcf durante 10 minutos a 4 ° C. * PASO OPCIONAL - Precleansing con proteína G agarosa. <ol><li> Tomar el sobrenadante y poner en el nuevo tubo de 15 ml halcón. </li><li> Añadir 500 l de proteína G agarosa. </li><li> Gire a la temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 4000 rpm durante 10 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Distribuir sobrenadante para que 500 l se utilizó como control de entrada (que contiene el ADN genómico solamente), y el resto se divide en dos tubos con 1.600 l de cada muestra - que son de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) muestras. </li><li> El control de entrada se sitúa en -80 ° CO / N hasta su posterior utilización. </li><li> A las muestras de chip - añadir volumen 1:10 de 10XFSB y 4μg de anticuerpos, entonces vórtice las muestras y girarlas a 4 ° C durante la noche. ! ATENCIÓN - La cantidad y la dilución de anticuerpos puede requerir de optimización. </li></ol> 2 º día ! ¡CUIDADO! - Comience a 2 º día lavando la proteína G agarosa que se utiliza para aislar el ADN nucleosomal. Desde bolas de agarosa son muy sensibles, es necesario cortar las cabezas de las puntas de pipeta siempre cualquier solución que contiene perlas de agarosa. 1. Sondeo de la proteína G perlas de agarosa para ADN <ol><li> Añadir 1,6 ml 1XFSB a 245 l de proteína G-agarosa (suficiente para 4 tubos) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml (loop). </li><li> Separar la solución en dos tubos de 2 ml y llenar cada uno de hasta 1,6 ml con 1X FSB. </li><li> Gire a temperatura ambiente durante 30 segundos y centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos. </li><li> Eliminar el sobrenadante con una aspiradora. </li><li> Añadir 1,6 ml de 1X FSB, una vez más. Girar las muestras durante 30 segundos y luego se centrifuga a 0,1 RCF durante 30 segundos. </li><li> Eliminar el sobrenadante, una vez más, y se combinan los dos tubos con 1,5 mL 1XFSB. </li><li> Añadir 15 ul de ADN de esperma de salmón sonicado (10mg/ml). ! ATENCIÓN - Este paso se debe, en principio, reducir la unión no específica de la immunoprecipitate a las perlas. Sin embargo, esto también podría dar lugar a falsos positivos de algunas de las secuencias de ADN (humano). </li><li> Gire a temperatura ambiente durante 30 minutos y centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Añadir 200 uL de 1XFSB. </li><li> Añadir 90 l de bolas de agarosa en cada muestra de chip. Gire a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Añadir 1 ml de 1XFSB en resto de bolas de agarosa para servir como un control negativo y girar a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Después de la incubación de una hora, se centrifuga la muestra y el control negativo en el 0,1 RCF durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante. </li></ol> 2. Lavado de las Perlas ! ¡CUIDADO! - Buffers de lavado debe mantenerse a 4 ° C hasta su uso, y deben ser utilizados sólo si son menos de un mes de edad. <ol><li> Añadir 1 ml de cada solución de lavado hasta el talón y giran durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos. </li><li> Desechar el sobrenadante con vacío. </li></ol> * Cada solución de lavado - Bajo la sal tampón de lavado - Elevada de sal tampón de lavado </p&gt; - Solución de cloruro de litio - sólo girar a temperatura ambiente durante 1 minuto! - Buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Elución * Paso crítico - Hacer Tampón de Elución fresco para cada experimento el día en que se va a utilizar. <ol><li> Añadir 250 l de buffer de elución recién preparada para cada muestra. </li><li> Girar durante 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 0,4 RCF durante 1 min. </li><li> Guardar el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (Loop). </li><li> Añadir 250 l de tampón de elución de cada muestra y agitar con la mano durante unos segundos. Luego, las muestras de vórtice durante 15 minutos en un mulitvortexer. </li><li> Centrifugar a 16 RCF rpm durante 4 minutos y guardar el sobrenadante en el mismo tubo de 2,0 mL (Loop). </li></ol> 4. Digerir las proteínas <ol><li> Añadir 10 l 0,5 M EDTA, 25 l 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml de proteinasa K (1 / 200 de la muestra) a cada muestra de chip. </li><li> Para cada control de entrada, agregar solución amortiguadora de lisis para la digestión de proteinasa K (1 / 10 de tampón de muestra) y 10mg/ml proteinasa K (1 / 200 de tampón de muestra). </li><li> Incubar de entrada y de muestras de chips de 52 ° C durante al menos 3 horas. </li></ol> 5. Fenol / cloroformo extracción ! PRECAUCIÓN - Experimento requieren fenol / cloroformo se debe realizar bajo el capó. Use guantes de nitrilo al manejar con fenol / cloroformo. <ol><li> Después de la incubación de 3 horas, le sumamos los 500 l de fenol-cloroformo a cada muestra. </li><li> Vortex todas las muestras de varios segundos, luego se centrifuga a 13 rpm RCF durante 5 minutos. </li><li> En este punto, dos fases estará presente y estamos interesados ​​en el contenido de la fase superior. Saque la fase superior y lo puso en un tubo de microcentrífuga 2 ml. </li><li> Añadir una mezcla de 2μL de glucógeno y 50μL de acetato de sodio 3M para cada muestra, junto con 1,375 ml de etanol al 100%. </li><li> Vortex todas las muestras de fuerza. Lugar en -80 ° C durante la noche. </li></ol> 3 º Día <ol><li> Extraer muestras de forma -80 ° C y los coloca en el hielo para que se descongele. </li><li> Centrifugar a 15 RCF durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento en el fondo del tubo. </li><li> Añadir 1 ml de etanol frío al 75% para cada muestra, y luego invertir 4-6 veces. </li><li> Centrifugar a 18 RCF durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Extraer el sobrenadante, una vez más y permitir que las pastillas se seque al aire. </li><li> Disolver pellets secos en 50 l de 4 mm de Tris-HCl, pH 8 y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

El protocolo descrito aquí es particularmente útil para los investigadores interesados ​​en las firmas de metilación de las histonas y / o ADN del cerebro humano, ya que estas marcas de la cromatina puede ser menos propensa a los artefactos post-mortem, en comparación con otros tipos de modificaciones, incluyendo (histonas) acetilación y fosforilación 1, 2. El cerebro postmortem se presta al estudio de la mono-nucleosomal los preparativos, el ADN permanece en gran parte unido a las histonas centrales, al menos en las muestras con...

Soluciones: <ul><li> Buffer nChIP Douncing: 10 mM Tris, 4 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 ajustar el pH a 7.5 </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl ajustar el pH a 7.5 </li><li> Sal de amortiguación de lavado a baja: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Buffer de lavado a alta sal: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl </li><li> Cloruro de litio Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% de ácido desoxicólico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl </li><li> Tampón TE: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Tampón de Elución: 0,1 M NaHCO 3, 1% SDS </li><li> Proteinasa K tampón de digestión (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, SDS 2%, NaCl 2M ajustar el pH a 8.0 </li><li> 3 M de acetato de sodio: 24,61 g de acetato de sodio anhidro (MW = 82.03) en 100 ml de agua destilada en autoclave. Ajustar el pH a 5.2 con ácido acético concentrado. </li></ul>

un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Enfermedades neuropsiquiátricas crónicas como la esquizofrenia, enfermedad bipolar y el autismo se cree que el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales que podrían resultar en alteraciones epigenéticas de la expresión génica y otras patología molecular. Tradicionalmente, sin embargo, los estudios de expresión en el cerebro post mortem se limitaron a la cuantificación de ARNm o proteína. Las limitaciones encontradas en la investigación postmortem del cerebro tales como variabilidad en el tiempo y la autolisis integridades tejido también es probable que el impacto de los estudios de estructuras de orden superior de la cromatina. Sin embargo, la organización nucleosomal de ADN genómico como el ADN: núcleo de unión de histonas - parece ser preservado en gran medida en muestras representativas de los bancos diferentes del cerebro. Por lo tanto, es posible estudiar el patrón de metilación y otras modificaciones covalentes de las histonas en definir loci del genoma en el cerebro postmortem. A continuación, presentamos una versión simplificada nativos inmunoprecipitación de cromatina (NChIP) protocolo para muestras de cerebro congelado (no fijos) humanos. A partir de la digestión nucleasa micrococcal de homogeneizados de cerebro, NChIP seguido por qPCR se puede completar en tres días. La metodología que aquí se presenta debe ser útil para dilucidar los mecanismos epigenéticos de la expresión génica en el cerebro humano normal y enfermo.

Hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limita a la cuantificación de ARN o de proteína. Con las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina se describe en este artículo, será posible asignar metilación de las histonas y otros reguladores epigenética de la expresión génica en el cerebro postmortem.

Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Se piensa que las enfermedades neuropsiquiátricas crónicas, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar y el autismo, son el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales...

Hola, soy Amish Matan y pertenezco al laboratorio del Dr. Sha Mc Barian en el departamento de psiquiatría de la Escuela de Medicina de UMass. Hoy les mostraré un procedimiento para la inmunoprecipitación de cromatina en tejido cerebral humano posmortem. Aunque el siguiente procedimiento no es muy complicado.Lo más emocionante es que hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limitaban a la cuantificación simple de ARNm y proteínas. Esta técnica en particular nos dará una mejor comprensión de la base mecanicista de la expresión génica tanto en el cerebro humano normal como en el enfermo. Así que comencemos a inmunoprecipitar la cromatina.Comenzamos con tejido cerebral humano postmortem previamente diseccionado y congelado. Es importante usar gafas de seguridad y trabajar en un área designada para manipular tejido humano. Al procesar estas muestras, el tejido cerebral se diluye con cinco veces el volumen del cerebro de tampón de sedimentación.Una vez que todo el tejido parezca haberse vuelto homogéneo en la solución, podemos transferirlo a un tubo de dos mil. Después de que el tejido haya sido homogenizado, agregue cinco unidades por mil de nucleasa micrococal

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Biología

La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.

Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C

Fuente: Méndez, F. M. et al., Inmunoprecipitación de cromatina nativa utilizando neuroesferas de tumores cerebrales murinos. J. Vis. Exp. (2018). Este video demuestra el aislamiento de complejos proteína-ADN de células de neurosfera derivadas de un tumor cerebral de ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina nativa. En él se detallan los pasos para la preparación de la cromatina, la inmunoprecipitación, el lavado y la digestión de proteínas para liberar el ADN para su análisis posterior.

Inmunoprecipitación de cromatina nativa de células de la neurosfera

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

En este trabajo describimos un método inmunoquímico sensible para mapear la distribución espacial de los derivados de oxidación de 5mC basado en el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y la amplificación de la señal de tiramida.

La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Con frecuencia se alteran mecanismos epigenéticos en glioma. Inmunoprecipitación de cromatina podría utilizarse para estudiar las consecuencias de las alteraciones genéticas en gliomas que resultan de cambios en las modificaciones de las histonas que regulan la transcripción de la cromatina estructura y gene. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina nativa de neuroesferas de tumor de cerebro murino.

Inmunoprecipitación de cromatina nativa usando neuroesferas del Tumor de cerebro murino

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en células y tejidos cerebrales, utilizando la tinción de inmunofluorescencia y métodos de adn-blot.

La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aprende la técnica de inmunoprecipitación de cromatina en tejido cerebral humano post mortem para estudiar metilación de histonas y reguladores epigenéticos. Este método permite comprender los mecanismos de expresión génica en cerebros normales y enfermos.

Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

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