Name: La titulación de coronavirus humanos mediante un ensayo de inmunoperoxidasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprende a cuantificar coronavirus humanos mediante el ensayo de inmunoperoxidasa, una técnica enzimática alternativa a los ensayos de placa. Este método permite determinar títulos virales en cepas sin efectos citopáticos.

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El protocolo de texto completo de este enfoque experimental está disponible en <a href="http://www.springerprotocols.com/">los Protocolos Springer</a> .

Los autores no tienen nada que revelar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

la titulación de coronavirus humanos mediante un ensayo de inmunoperoxidasa

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Cálculo de los títulos virales infecciosas representa un enfoque experimental básico y esencial para los virólogos. Ensayos clásica placa no se puede utilizar para detectar virus que no causan importantes efectos citopáticos, que es el caso de las cepas 229E y OC43 de coronavirus humano (HCoV). Un ensayo alternativo inmunoperoxidasa indirecta (IPA) es aquí descritos para la detección y valoración de estos virus. Células susceptibles son inoculadas con diluciones seriadas logarítmicas de las muestras en una placa de 96 pocillos. Después de un crecimiento viral, detección de virus por el IPA se obtiene el título de virus infecciosos, expresado como &quot;la dosis infecciosa cultivo de tejidos&quot; (TCID50). Esto representa la dilución de una muestra que contiene el virus en la que la mitad de una serie de pozos de laboratorio contienen replicación del virus. Esta técnica es un método fiable para la valoración de HCoV en muestras biológicas (células, tejidos o fluidos).

En este vídeo, se demuestra un método alternativo para la detección y titulación de virus utilizando una técnica de detección de antígenos enzimática conocida como prueba de inmunoperoxidasa. Aquí le mostraremos cómo recoger las muestras virales, preparar las células para la prueba, y finalmente la prueba de inmunoperoxidasa utilizando diluciones seriadas para determinar el título viral.

La titulación de coronavirus humanos mediante un ensayo de inmunoperoxidasa

La determinación de los títulos virales infecciosos es un enfoque experimental básico y esencial para los virólogos. Los ensayos de placa clásicos no pueden utilizarse para...

El cálculo de títulos virales infecciosos es un enfoque experimental básico. Sin embargo, el método clásico de utilizar ensayos de placas no es el más confiable para virus que no producen efectos citopáticos, como los coronavirus humanos. En este video, demostramos un método alternativo para la detección y titulación de un virus mediante una técnica enzimática de detección de antígenos conocida como ensayo inmunoperoxidásico.Aquí le mostraremos cómo recolectar sus muestras virales, preparar las células para la prueba y, finalmente, realizar el ensayo inmunoperoxidásico mediante diluciones seriadas para determinar la título viral. Hola, mi nombre es el Dr. Pierre Albo, director del Laboratorio de Neuroinmunología del Instituto AM RIP en Laval, Quebec, Canadá. Hoy demostraremos cómo cuantificar cepas virales humanas de color, OT 43 y dos nueve E, que son cepas prototípicas de estos virus que no producen placas en cultivo.Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo para sortear este problema. Este se llama ensayo inmunoperoxidasa. Para demostrar este protocolo, les presentaré a ustedes, mi estudiante Gabrielle Marol, mi técnico Francis Nader y mi asociada de investigación Ellan Jacob.Así que comencemos. Primero, queremos preparar nuestras muestras de tejido. Comenzamos pesando previamente los tubos estériles que usaremos para recolectar cada órgano.Una vez que hayamos determinado el peso de cada tubo vacío, diseccionaremos rápidamente los órganos de interés en condiciones estériles y luego los mantendremos sobre hielo. Es importante recordar enjuagar los instrumentos con etanol al 70 % entre cada disección. Después de haber recolectado los órganos, determinamos el peso de cada muestra biológica.A continuación, homogeneizaremos las muestras de tejido con PBS estéril al 10 % utilizando un homogeneizador de politrón en una cabina de flujo laminar. Encienda el homogeneizador y luego eleve y baje el tubo para romper el tejido. Después de homogeneizar cada muestra, lave el aparato una vez con agua estéril, una vez con etanol al 70 % y finalmente con PBS antes de procesar la siguiente muestra de tejido.Después de que las muestras hayan sido homogenizadas, centrifugue los tubos a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. A 1000 G, recoja los sobrenadantes en nuevos tubos estériles. En este punto, las muestras virales pueden procesarse para la detección por inmunoperoxidasa.De lo contrario, puede congelarlos inmediatamente a menos 80 grados Celsius y almacenarlos hasta que esté listo para realizar los ensayos. A continuación, queremos preparar las muestras celulares. Existen diferentes métodos para preparar células adherentes y no adherentes, pero ambos implican la recolección de títulos virales intracelulares y extracelulares.Con el fin de determinar la producción viral extracelular en células adherentes, recolectamos sobrenadantes y tubos estériles de las células infectadas, los cuales se analizarán en los momentos adecuados tras la infección. Para la estimación de los títulos virales intracelulares, queremos primero eliminar el medio, lavar las células con PBS tibio y estéril, y luego añadir el mismo volumen o un volumen conocido de medio, realizando a continuación tres ciclos de congelación-descongelación a menos 80 grados Celsius. Esto lisará las células y liberará las partículas virales al medio.Para las células no adherentes, primero centrifugamos las células a mil G durante cinco minutos. Después de formar el precipitado celular, recolectamos los sobrenadantes en tubos estériles. Esto representa la porción extracelular del virus infeccioso.A continuación, suspendemos el sedimento celular en el mismo volumen que el sobrenadante recolectado o en un volumen conocido de medio de cultivo. Ahora realizamos tres ciclos de congelación-descongelación a menos 80 grados Celsius para lisar las células y liberar partículas virales en el medio. Esto representa la fracción intracelular del virus infeccioso.Después de la lisis de células adherentes o no adherentes, centrifúgelas durante cinco minutos a mil gs. Ahora se puede recoger el sobrenadante en nuevos tubos estériles y se pueden analizar los títulos mediante el ensayo de inmunoperoxidasa. Asimismo, la muestra también puede congelarse inmediatamente a menos 80 grados C y almacenarse hasta el análisis.Con el fin de evaluar la productividad de nuestra infección por coronavirus humano en nuestras muestras biológicas, deseamos utilizar un ensayo inmunoperoxidásico en células susceptibles al coronavirus. Primero, se utiliza un tratamiento con tripsina para crear una suspensión de células susceptibles a partir de una monocapa confluyente. Al trabajar con coronavirus humano, se emplean las células 229E L-1 32 como células susceptibles, y para el coronavirus humano OC43, se utiliza la línea celular HRT-18 tras generar una suspensión de células susceptibles. Estas se siembran en una placa de 96 pozos para cultivo de tejidos.Si se utiliza una pipeta multicanal, distribuya cien microlitros por pocillo de la suspensión celular utilizando la concentración adecuada de células. El número de células susceptibles por pocillo dependerá del tipo de células utilizadas y del momento en que se realice la inoculación de las células. Después de sembrar, consulte nuestro protocolo de Springer para obtener información más detallada.Antes de comenzar el ensayo inmunoperoxidásico, es necesario infectar las células susceptibles con las muestras que hemos preparado previamente. Cuando las células susceptibles alcancen una confluencia del 70 al 80 %, retire el medio de cada placa de 96 pocillos envolviendo la placa en papel estéril y agitándola suavemente boca abajo sobre otra hoja de papel estéril. A continuación, añada a cada pocillo cien microlitros de MEM alfa suplementado con 1 % de suero bovino fetal (FBS).Cada muestra debe analizarse en cuatro columnas adyacentes. En la misma placa, coloque cien microlitros por pocillo de las alícuotas que se van a probar en la primera fila. Normalmente, las células susceptibles se inoculan con diluciones logarítmicas en serie de las muestras infectadas.Para hacer esto, agregue 11 microlitros por pocillo de la misma muestra nuevamente en cuatro pocillos. Ahora, en la segunda fila de la placa de 96 pocillos, mezcle con la pipeta multicanal aspirando y expulsando tres veces y transfiera 11 microlitros de cada pocillo a la tercera fila, y así sucesivamente hasta la última fila de la placa. Una vez que haya inoculado las células, incube las placas en una cámara humedecida a 33 grados Celsius con 5%CO2 para el coronavirus humano.Las células infectadas con 2290 se incuban durante cinco días y las células infectadas con el coronavirus humano OC 43 se incuban durante cuatro. Después de este tiempo, podemos proceder a la detección del virus.Después de la incubación, estamos listos para detectar el virus. Primero comenzamos por eliminar completamente el medio. Esto lo hacemos agitando las placas sobre toallas de papel no estériles dentro de la cabina de flujo laminar.A continuación, enjuagamos delicadamente las células llenando suavemente los pocillos con PBS. Utilizando una pipeta multicanal, eliminamos el PBS de los pocillos y retiramos cualquier resto de PBS envolviendo cada placa con papel de tejido.Después de lavar las células, deberá fijarlas con metanol al cien por ciento que contenga peróxido de hidrógeno al 0,3 %. Añada la mezcla de metanol a las células y deje la placa reposar entre 15 y 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación de 30 minutos, se elimina el fijador sacudiendo las placas sobre el fregadero. El fijador residual se elimina sacudiendo la placa boca abajo sobre varias toallas de papel colocadas sobre la superficie de trabajo.Luego, déjelo secar completamente al aire, boca arriba, durante aproximadamente 15 a 30 minutos mientras las células se secan. Puede preparar una solución de anticuerpos específica para el virus en la dilución adecuada en PBS. A continuación, agregue cien microlitros del anticuerpo viral específico a cada pocillo de las placas de incubación y incube durante dos horas a 37 grados Celsius.Después de la incubación, retire completamente el medio agitándolo sobre el fregadero. Enjuague la placa llenando los pocillos con PBS. Luego, agite la placa sobre el fregadero y enjuáguela con PBS.Otras dos veces más. Elimine todo el PBS residual agitando el recipiente boca abajo sobre toallas de papel no estériles colocadas sobre la superficie de trabajo. A continuación, añada cien microlitros a cada pocillo de anticuerpo secundario en una proporción de uno a 1000.Dilución en PBS, incubar la placa durante dos horas a 37 grados sin CO2, 30 minutos antes del final de la incubación. Preparar el reactivo de detección, que es una mezcla de DAB con PBS y peróxido de hidrógeno al 0,01 %. Enjuagar la placa tres veces en PBS como se realizó previamente.Después de lavar la placa, añada cien microlitros de reactivo de revelado a cada pozo. Incube durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente o hasta que el control positivo esté teñido. Para detener la reacción, lave la placa una vez con agua como se hizo previamente con PBS y agregue cien microlitros de agua desionizada a cada pozo.Finalmente, lea las placas con el microscopio óptico para cuantificar todos los pocillos que presenten células teñidas. Ahora, por fin, podemos determinar el título de nuestro virus. Esto puede calcularse utilizando el método car, cuya ecuación puede encontrar en el protocolo de Springer que acompaña a este video.Acabamos de mostrarle cómo titular los coronavirus humanos al realizar este procedimiento. Es importante recordar que está trabajando con muestras que contienen ambos virus y que debe trabajar en condiciones estériles. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Fuente: Bouillier, C., et al. Generación, amplificación y titulación de virus sincitial respiratorio recombinantes. J. Vis. Exp. (2019)El video demuestra un ensayo de titulación por placas utilizado para cuantificar el virus respiratorio sincitial recombinante infeccioso (RSV) en monocapas de células epiteliales. Se muestra la infección de células huésped con suspensiones virales diluidas en serie, la restricción de la diseminación viral mediante una capa superior semisólida a base de celulosa...

Ensayo de titulación por placas para la cuantificación del virus sincitial respiratorio infeccioso

Este video muestra ensayos de microneutralización para medir anticuerpos neutralizantes utilizando células de riñón canino Madin-Darby que sobreexpresan ácido siálico ligado a α2,6 en sueros humanos. Este ensayo se utiliza a menudo para la serología humana de la...

Un ensayo de microneutralización para medir los títulos de anticuerpos neutralizantes en el suero humano

Este video muestra un ensayo de neutralización que mide la eficacia del suero para neutralizar los virus SARS-CoV-2. Involucra virus pseudotipados, dilución en suero y cuantificación basada en luminiscencia, revelando el título de neutralización.

Evaluación de anticuerpos neutralizantes funcionales contra el SARS-CoV-2

Describimos el ensayo de lectina ligado a enzimas (ELLA) para medir los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en sueros. El ensayo utiliza aglutinina de cacahuete para cuantificar los residuos de galactosa que se vuelven accesibles cuando la NA elimina el ácido siálico de las placas de 96 pocillos recubiertas de fetuina.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Este estudio describe una   -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

Este protocolo muestra un enfoque preciso y objetivo para visualizar las valoraciones virales utilizando cristal violeta, comparándolo con la microscopía óptica y la tinción inmunocitoquímica.

Uso de crystal violet para mejorar la lectura basada en el efecto citopático visual para la valoración viral utilizando ensayos TCID50

Los virus pseudotipados (PV) son viriones con replicación defectuosa que se utilizan para estudiar las interacciones huésped-virus en condiciones más seguras que la manipulación de virus auténticos. Aquí se presenta un protocolo detallado que muestra cómo se pueden usar los PV del SARS-CoV-2 para probar la capacidad neutralizante del suero de los pacientes después de la vacunación contra el COVID-19.

Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización

Este protocolo describe la aplicación de un nuevo pseudovirus híbrido alfavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) como plataforma para la cuantificación rápida de la infectividad de las variantes del SARS-CoV-2 y su sensibilidad a los anticuerpos neutralizantes.

Aplicación del pseudovirus Ha-CoV-2 para la cuantificación rápida de variantes del SARS-CoV-2 y anticuerpos neutralizantes

Aprende a cuantificar coronavirus humanos mediante el ensayo de inmunoperoxidasa, una técnica enzimática alternativa a los ensayos de placa. Este método permite determinar títulos virales en cepas sin efectos citopáticos.

La titulación de coronavirus humanos mediante un ensayo de inmunoperoxidasa

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