Name: Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Aprende a mantener y pasar células madre embrionarias humanas (hESCs) en condiciones libres de células alimentadoras usando Matrigel. Este método demuestra la confirmación de pluripotencia mediante microscopía de inmunofluorescencia.

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Estudios en humanos con células madre embrionarias en el laboratorio Teitell el apoyo de un Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), las semillas de subvención RS1-00313. Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de amplias e Investigación de Células Madre de la UCLA, en especial el Dr. Amander Clark, el doctor Jerome Zack, y los miembros del Fondo para el UCLA amplio núcleo de célula madre Instituto por el apoyo de nuestros estudios.

HESCs división de Matrigel de Matrigel Por lo general, una confluencia de 6 pocillos de hESCs en Matrigel se puede dividir 1:03-1:05 a otra placa de Matrigel, con los pozos cada vez más confluentes 4-5 días después de partir. <ol><li> CM y las placas de Matrigel se preparan como se describe arriba antes de separarse. </li><li> En el día de la división, lave cada pocillo para dividir con PBS 1X, pH 7,4, agregar 1 ml de 1mg/ml Dispasa (la solución diluida de valores 5mg/ml con DMEM/F12 los medios de comunicación) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS 1X, pH 7,4, agregar 1 ml de ES medios de comunicación sin bFGF, use una espátula para raspar las colonias de células de la parte inferior del pozo, recoger las hESCs en suspensión en un tubo de 50 ml de halcón, y el precipitado por centrifugación a 200 g por 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Para volver a la placa de hESCs en las placas de Matrigel, primero se deben lavar las placas con Matrigel DMEM/F12 y añadir 2,5 ml de la CM complementado con 10ng/ml bFGF por pozo. Resuspender las células madre de pellets en un volumen adecuado de CM complementado con 10ng/ml bFGF, pipeta de la suspensión celular arriba y hacia abajo tres veces. (NOTA: Cuando hESCs para la división proviene de las placas Matrigel, los grupos son muy fáciles de romper, por tres rondas de pipeteado es suficiente y más de pipeteo puede alterar demasiado las colonias y hacer que las células individuales.) Alícuota de 0,5 ml de suspensión de células madre por grupos pocillo de la placa de 6 pocillos Matrigel para lograr 3 ml por pocillo en un volumen final. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C. </li></ol> Detección de marcadores de pluripotencia por microscopía de inmunofluorescencia Microscopio de inmunofluorescencia se utiliza para examinar la expresión de marcadores de células madre pluripotencia Oct-4 y 4-SSEA durante el cultivo. <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de un bien y lavar con PBS 1X, pH 7,4. Añadir 2 ml de 3,7% de formaldehído al pozo para fijar durante 10 min. </li><li> Enjuague con 1XPBS, pH 7,4, agregar 2 ml de metanol para el bienestar y el lugar de -20 º C durante 2 min. </li><li> Enjuague con 1XPBS, pH 7,4, y el bloque con 1 ml de 0,2% serume albúmina bovina (BSA) durante 5 min. </li><li> Añadir 1 ml de anticuerpos Oct-4 o anti-h/mSSEA-4 (dilución 1:200 en 0,2% de BSA) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche. (NOTA: para SSEA-4 tinción, vaya directamente al paso 6) </li><li> Enjuáguese la boca tres veces con 1XPBS, pH 7,4, agregar FITC-conjugado de IgG de conejo (dilución 1:500 en 0,2% de BSA) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Enjuague tres veces con 1XPBS, pH 7,4, y poner una gota de solución de montaje (puede contener DAPI nuclear si la visualización se desea) en el centro del pozo. Poner el cubreobjetos en la parte superior de las células, sello con el esmalte de uñas, y evaluar por microscopía de inmunofluorescencia. </li></ol> Recibos de embriones humanos con células madre ES medios de comunicación (medios de comunicación de células madre embrionarias): DMEM/F12 - 400ml Octavos de final de suero Replacer - 100 ml No aminoácidos esenciales - 5 ml 200 mM Glutamax / BME de soluciones - 5 ml Penicilina / estreptomicina - 5 ml Mezclar bien y guardar final de Medios de cultivo células madre en botellas de 500 ml a 4 ° C. Bueno para un máximo de dos semanas. MEF cultura de los medios: DMEM - 1000 ml FBS - 100 ml No aminoácidos esenciales - 10 ml Glutamina - 10ml Penicilina / estreptomicina - 10ml Mezclar bien y guardar final de Medios de Cultivo MEF a 4 ° C. 200 mM Glutamax / BME de solución: Glutamax - 100 ml β-mercaptoetanol (solución de archivo de 14,3 millones) - 140 μ1 Mezclar dos soluciones bien y luego las alícuotas de 10 ml. Mantenga alícuotas a -20 ° C. bFGF solución (concentración final de stock: 10 microgramos / ml): bFGF (FGF2) - 50 mg 0,1% de BSA en 1XPBS, pH 7,4 - 5 ml Disolver 50 microgramos bFGF en 5 ml de BSA al 0,1% para un 10 ug / ml de caldo. Alícuota en porciones de 500 microlitros. Almacenar a -80 ° C. Colagenasa IV de la solución (1mg/ml): Colagenasa IV - 50 mg DMEM/F12 los medios de comunicación - 50ml Agregue el polvo de la colagenasa IV a un tubo de 50 ml de halcón. En la capilla, la mezcla en 50 ml de agua estéril DMEM/F12 los medios de comunicación. Vortex la solución de &lt;1 min. para asegurarse de que el polvo se disuelva. En la capilla, pasan por un filtro de 0,22 micras en un nuevo tubo de 50 ml estéril halcón. Esta solución es buena para un máximo de 2 semanas si se almacena a 4 ° C. Dispasa solución (1mg/ml): Dispasa 5mg/ml - 2 ml DMEM/F12 los medios de comunicación - 8ml Alícuota comerciales 5mg/ml solución Dispasa y almacenar a -20 ° C. Diluir dispasa a 1mg/ml utilizando DMEM/F12. Esta solución puede conservarse durante una semana a 4 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Esta serie de tres videos muestra cómo crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en fibroblastos de embriones de ratón (MEF), las células de alimentación (video 1), cómo paso a Matrigel libre de células de alimentación placas (video 2), y cómo mantener la hESCs por pases en el alimentador de Matrigel de células en condiciones libres (video 3). Numerosos estudios previos mostraron que el mantenimiento de hESCs viable, no diferenciado requiere la cultura en las células inactivadas MEF alimentador. Sin embargo, para muchos experimentos...

<table><tbody><tr><td>Sustituto de suero para knockout (KSR)</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reactivo</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Reactivo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reactivo</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Oct-4</td><td>Reactivo</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de ratón IgG3 conjugado con fito&amp;#8211;eritrina anti-h/mSSEA-4</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con FITC antiinmunoglobulina G de conejo</td><td>Reactivo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

desde mefs a matrigel 3: hescs pases de matrigel en matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

Este video demuestra cómo mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESC) en condiciones libres de células alimentadoras y cómo realizar el pasaje continuo...

Para dividir células madre embrionarias humanas cultivadas sobre Matrigel dos Matrigel. Comenzamos con una placa de seis pocillos confluente de células madre embrionarias sobre Matrigel, que pueden dividirse de uno a tres, o de uno a cinco, en otra placa con Matrigel. Esto permite que los pocillos vuelvan a alcanzar la confluencia cuatro a cinco días después del paso, el mismo día del trasplante.Lave cada pocillo que se va a dividir con un XPBS pH 7,4. A continuación, agregue un mililitro de disolución de un miligramo por mililitro a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos. Lave cada pocillo tres veces con un XPBS pH 7,4.Luego, agregue un mililitro de medio para células madre embrionarias sin BF GF y utilice un raspador celular para desprender las colonias del fondo de la placa. Recoja las células madre embrionarias resuspendidas en un tubo Falcon de 15 mililitros y forme un sedimento mediante centrifugación a 200 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para recultivar las células madre embrionarias humanas en placas de matrigel, primero lave las placas de matrigel con D-M-E-M-F 12 y agregue 2,5 mililitros de medio condicionado con metilo suplementado con 10 nanogramos por mililitro.Después de centrifugar las células, suspender el sedimento de células madre auriculares humanas en un volumen adecuado de condición de metilo. Agregar medio suplementado con 10 nanogramos por mililitro de BFGF y pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo tres veces.Tenga en cuenta que los agregados de células madre procedentes del Matrigel se desintegran fácilmente. Por lo tanto, pipetear tres veces debería ser suficiente para romper los agregados, sin que las colonias queden demasiado pequeñas. Finalmente, alícuota 0.5 mililitros de suspensión de células madre humanas por pocillo para obtener tres milis por pocillo.Como volumen final, asegúrese de que los agregados celulares estén uniformemente dispersos y luego coloque la placa en un incubador a 37 grados. Dependiendo de la línea específica de células madre amry, las células madre amry volverán a alcanzar confluencia entre cuatro y cinco días después del reparto. Cuando las colonias comiencen a tocarse entre sí, es importante saber si sus células madre humanas amry mantienen o no la pluripotencia o "stemness" en cultivo.Para comprobar la pluripotencia de las células durante el cultivo de células madre, utilizamos microscopía de inmunofluorescencia para examinar la expresión de los marcadores de pluripotencia, OCT4 y SSEA4, en uno de los pocillos. Nuestra placa de seis pocillos se fija y tiñe para OCT4 y SSEA4. Si observamos que las células están marcadas fluorescentemente para ambos marcadores, entonces sabemos que nuestras células madre embrionarias humanas han mantenido la pluripotencia y pueden utilizarse para nuestros experimentos.Acabamos de mostrarle cómo cultivar y mantener células madre embrionarias humanas potentes, junto con fibroblastos embrionarios, células alimentadoras y en condiciones libres de campo sobre metro job. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

Diferenciación dirigida de células embrionarias humanas en específico ha generado mucho interés en la medicina regenerativa. Ofrecemos una concisa, paso a paso el protocolo para determinar...

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

La calidad de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) está dictada por la cepa derecha de ratón tal como CF-1. Pluripotencia-MEFs de apoyo y medios de comunicación condicionado (CM) obtenido a partir de éstas debe contener concentraciones óptimas de activina A, Gremlin y Tgfβ1 necesarios para la Activina / Nodal y las vías de FGF de manera cooperativa mantener la auto-renovación y pluripotencialidad.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.

La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Nosotros, basándonos en el conocimiento de la biología del desarrollo y la investigación publicada, desarrollamos un protocolo optimizado para generar de manera eficiente neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo A9 a partir de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas, que serían útiles para el modelado de enfermedades y la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson.

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Aprende a mantener y pasar células madre embrionarias humanas (hESCs) en condiciones libres de células alimentadoras usando Matrigel. Este método demuestra la confirmación de pluripotencia mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

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