Imágenes de las células efectoras T de memoria en el oído después de la inducción de DTH adoptivos
August 14th, 2008
Aquí se demuestra un método para inducir y registrar el progreso de un retraso de tipo de hipersensibilidad (DTH) la reacción en el oído de la rata. Esto es seguido por una demostración de la elaboración de tejidos de ratas oído para la imagen de dos fotones de la respuesta del efector / memoria de células T.
Hola, soy Melanie Matthew. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Micah Hollins en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y hoy, junto con la Dra. Christine Beaton, vamos a mostrarles cómo obtenemos imágenes del efecto de respuesta o la población de células T de memoria en el oído de rata.
La Dra. Christine Beaton primero inducirá la hipersensibilidad de tipo retardado DTH en el oído de la rata. Y luego pasaremos a la obtención de imágenes in situ de la oreja de rata mediante dos fotomicroscopías. Hace dos días inyecté GFP marcado con células T específicas de albúmina en hiper a un Lewis.
Y hoy voy a desafiar a la misma rata en la oreja. Así que en el oído derecho voy a inyectar albúmina. Y en el oído izquierdo voy a inyectar un poco de PBS.
La dosis de albúmina que me inyecto es de 20 microgramos en 20 microlitros. Y la albúmina que estoy usando es una mezcla de Texas Red etiquetada de albúmina y no etiquetada de albúmina. Así que este es el to right en el que les voy a mostrar cómo voy a inyectar.
Así que tengo mi mano izquierda, soy diestro. Así que me quité el guante con la mano izquierda para poder poner un dedo debajo de la oreja y el otro encima para estirar la piel y poder ver exactamente dónde estoy con la aguja y pasar entre las dos capas de piel en el aire, que es muy fina. Así que para eso utilizo agujas de calibre 27 para tener algo extremadamente delgado para entrar allí.
Así que si le doy la vuelta, definitivamente ves a dónde se fue el rojo de Texas y a dónde se fue el PBS. Así que ahora estamos 42 horas después del desafío aquí y voy a usar un micrómetro con resorte para medir el grosor de la oreja. Así que voy a medir ambos oídos, el oído derecho que fue desafiado con la albúmina y el oído izquierdo que no fue desafiado y la diferencia en su grosor nos dará una idea de la intensidad de la inflamación.
Oh, 62, 0, 60, 0, 61, 0, 60, o 58, o 57, o 57. Y la otra oreja 4, 49, 4, 55, 4, 48.4, 47, 4, 4, 46, 4, 50. Hi.So Christine Beaton nos acaba de dar la rata que retiró después de medir la respuesta DTH.
Los hemos transportado hasta aquí en el hielo. Esta es la oreja izquierda de la rata. Y estamos aquí ahora en el laboratorio de Ian Parker haciendo dos microscopías de fotones.
Así que voy a preparar estos oídos para la toma de imágenes in situ de dos fotones. Así que voy a preparar una de las orejas de rata aquí en la base de la oreja. El tejido es mucho más grueso y tenemos algo de pelo que sobresale y que va a ser un poco desordenado si empiezo a cortarlo.
Así que lo primero que voy a hacer es cortar un poco de ese pelo. Solo estoy sosteniendo suavemente la oreja. Mi dedo hace que sea mucho más fácil controlar el tejido cuando lo sostienes entre el pulgar y el índice.
Lo prefiero a usar fórceps porque los fórceps, simplemente, no puedo sentir lo que está haciendo el tejido con tanta facilidad y siempre estamos preocupados por dañar el tejido. Así que queremos ser capaces de sentir lo que estamos haciendo con él. Así que me gusta usar mis dedos.
Esta es la capa dérmica que se desprende de aquí en el oído de la rata. Entonces, mientras recortaba parte del vello, pude recortar suavemente algunas de esas dermis. Hay unas tijeras de disección muy pequeñas para hacerlo, solo unas bonitas tijeras curvas.
No querrás pinchar el tejido y puedes ir subiendo desde la base de la oreja hasta la parte superior, simplemente cortando suavemente parte de la capa dérmica. Por lo tanto, no necesitamos una ventana muy grande para la obtención de imágenes. Esta área de aquí será suficiente para obtener algunas imágenes bonitas de las células que se infiltran en el tejido.
Como pueden ver, todavía tenemos algunos vasos sanguíneos intactos aquí en la base de la oreja y prácticamente hasta la punta de la oreja. Toda esta área será realmente buena para obtener imágenes DTH. Así que voy a seguir adelante y cortar ese pedazo de tejido que he expuesto para hacer un pequeño pedazo de tejido que podamos pegar a nuestra etapa de imagen.
Así que haz un corte aquí, dale la vuelta. Puedo cortar aquí. Tenemos un pequeño pedazo de tejido que podemos preparar en nuestro telescopio de dos fotones para obtener imágenes.
Se trata de cubreobjetos de plástico irrompibles que cortamos a la medida de nuestro tejido. Y luego montamos el pañuelo en estos usando el bono de apuesta. Y luego aseguramos estos cubreobjetos de plástico irrompibles con grasa de silicona a nuestra etapa de imágenes in situ.
Voy a tomar este pequeño trozo de tejido de aire, tiene un poco de curvatura, así que voy a tener que aplanarlo mientras lo pego. No es lo ideal, pero funcionará. Así que simplemente tomas uno de estos cubreobjetos y lo cortas, estimas el tamaño de tu oreja y cortas un poco más grande de lo que crees que va a ser.
Para montar nuestro pañuelo en la funda. Usamos un súper pegamento seguro para pañuelos llamado bet long. Lo obtenemos de 3M y solo ponemos un par de gotas de eso en nuestro comprobante.
No quiero tener demasiado. Y también debes asegurarte de que se distribuya por igual. Así que voy a tomar un pequeño trozo de papel para lentes y usar la esquina para absorber el pegamento a través del cubreobjetos aquí.
Subiendo un poco el pegamento extra y tan pronto como este pegamento toque agua, se curará. Por lo tanto, debe tener mucho cuidado con su muestra de tejido. Así que voy a agarrar la esquina del tejido aquí que probablemente no vamos a imaginar porque está en la parte curva.
Voy a secarlo un poco. La parte inferior, justo en el papel de la lente para que se seque todo. Y voy a tocar la esquina de la misma, este pañuelo de oreja de rata con la fundatoria.
Y debería curarse inmediatamente donde lo he tocado. El resto, solo voy a aplanar un poco presionando suavemente sobre él, los bordes. Así que espero que podamos tener un buen marco de imagen.
Así que ahora lo que voy a hacer es curar el pegamento sumergiéndolo en medio. Entonces, para evitar que el pegamento se pegue a la parte superior del tejido, le damos la vuelta y lo sumergimos lentamente en una esquina primero en nuestro depósito de medios y debe estar bien pegado y podemos obtener imágenes en nuestra cámara de imágenes de tejido. Así que ahora vamos a montar el pedazo de tejido que preparamos para la imagen in situ, el pedazo de tejido de cerveza en el escenario.
Así que aquí está nuestro trozo de pañuelo con la grasa de silicona en la parte inferior, y simplemente lo colocamos suavemente en el flujo de medios. Ahora está pegada a la parte inferior del escenario la grasa de silicona. Ilumine el flujo de medios con nuestra sonda de temperatura justo al lado.
Y ahora nos vamos a centrar. Así que voy a encender nuestro enfoque, nuestra nueva luz, nuestra cáscara brillante. Así que voy a tomar nuestro objetivo de 20 x y bajarlo a la recámara.
Asegúrate de que no toque el tejido. Mire a través del ocular y concéntrese en el tejido de nuestro oído. Y ahí está.
Aquí se ven folículos pilosos verdes autofluorescentes en la capa dérmica de la oreja de rata. Alrededor de estos folículos pilosos hay una densa capa de colágeno. Esta es una capa que eliminamos para la obtención de imágenes de fotones T de las células de memoria del T fector.
Los folículos pilosos autofluorescentes oscurecerán la imagen como el colágeno brillante de la capa dérmica superior. Bien, aquí pueden ver que tenemos APC que han adoptado volin conjugado rojo de Texas, y están ubicados a lo largo de estas fibras de colágeno azul. Las fibras de colágeno son azules debido a la generación de segundos armónicos que obtenemos en las imágenes de fotones a lo largo de las fibras de colágeno.
Disponemos de tcell altamente móvil. Se arrastran hacia arriba y hacia abajo por las fibras de colágeno e interactúan con las APC. Así que en este video viste a la Dra. Christine Beaton, inducir DTH adoptiva en la rata Lewis.
Y luego le mostramos nuestra preparación del oído para la obtención de imágenes, las células de memoria efectoras T sensibles y el oído de rata y nuestras dos técnicas de fotones para hacerlo.
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Visión general
Este artículo demuestra un método para inducir y registrar reacciones de hipersensibilidad tardía (DTH) en la oreja de rata, seguido de la preparación del tejido de la oreja de rata para la imagen de dos fotones de las respuestas de las células T.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Neurociencia
- Biofísica
Antecedentes
- La hipersensibilidad tardía (DTH) es una respuesta inmune clave.
- Entender la dinámica de las células T es crucial para la investigación inmunológica.
- La microscopía de dos fotones permite la imagen in situ de las respuestas celulares.
- Los modelos de rata son comúnmente utilizados para estudiar respuestas inmunes.
Propósito del estudio
- Inducir y registrar reacciones de DTH en las orejas de las ratas.
- Visualizar poblaciones de células T efectoras y de memoria.
- Mejorar la comprensión del comportamiento de las células T in vivo.
Métodos utilizados
- Inducción de DTH en el tejido de la oreja de la rata.
- Inyección de células T etiquetadas con GFP.
- Microscopía de dos fotones para la imagen.
- Análisis in situ de las respuestas de las células T.
Principales resultados
- Inducción exitosa de DTH en el modelo de oreja de rata.
- Visualización de poblaciones de células T utilizando microscopía de dos fotones.
- Insitios sobre la dinámica de las respuestas inmunes in vivo.
- El método demostrado puede ser aplicado a más estudios inmunológicos.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar las reacciones de DTH.
- La imagen de dos fotones es efectiva para observar el comportamiento de las células T.
- Esta investigación contribuye a la comprensión de las respuestas inmunes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing CCR7- effector/memory T cell recruitment and activation in vivo.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through direct observation of T cell-APC interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating T cell motility patterns with inflammatory intensity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue explants for consistent, reproducible imaging of immune cell dynamics.
- Operational Value: Establishes a platform for quantitative readouts such as cell tracking, interaction frequency, and infiltration depth.
- Scalability: Uses minimally processed ear tissue compatible with high-resolution imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains immunological relevance by preserving native tissue architecture and cell-cell interactions during imaging.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of immune responses in the same model.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in lead identification by providing direct evidence of target engagement in tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing T cell responses to antigen challenge in a controlled DTH model.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized thickness and mounting for reproducible two-photon imaging.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cell velocity, track length, and spatial distribution relative to collagen and APCs.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical by using the same rat model for both induction and imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple immunology targets and antigen-specific T cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of effector memory T cell function in tissue.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging conditions to improve reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking T cell dynamics to inflammatory outcomes in a predictive model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by validating target effects on immune cell behavior prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in adoptive T cell transfer, DTH induction, and two-photon microscopy.
- Dependent on access to two-photon microscopes with second harmonic generation capability for collagen visualization.
- Necessitates standardized tissue handling protocols to ensure consistent mounting and viability during imaging.
- Involves adaptation considerations when applying the ear preparation method to other tissue types or disease models.
- Limited by the need for antigen-specific T cell lines and appropriate controls to distinguish specific from nonspecific inflammation.
