Imágenes de las células efectoras T de memoria en el oído después de la inducción de DTH adoptivos
14 de agosto de 2008
Aquí se demuestra un método para inducir y registrar el progreso de un retraso de tipo de hipersensibilidad (DTH) la reacción en el oído de la rata. Esto es seguido por una demostración de la elaboración de tejidos de ratas oído para la imagen de dos fotones de la respuesta del efector / memoria de células T.
Hola, soy Melanie Matthew. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Micah Hollins en la Universidad de California en Irvine, en el Departamento de Fisiología y Biofísica. Y hoy, junto con la Dra. Christine Beaton, les mostraremos cómo obtenemos imágenes de la población de linfocitos T de respuesta o de memoria en la oreja de la rata.
Primero, la Dra. Christine Beaton inducirá la hipersensibilidad de tipo retardado DTH en la oreja de la rata. Luego pasaremos a la imagenología in situ de la oreja de la rata mediante microscopía bifotónica. Hace dos días inyecté linfocitos T específicos contra albúmina marcados con GFP en una Lewis hipersensibilizada.
Hoy voy a desafiar a la misma rata en el oído. Así que en el oído derecho voy a inyectar albúmina. Y en el oído izquierdo simplemente voy a inyectar algo de PBS.
La dosis de albúmina que estoy inyectando es de 20 microgramos en 20 microlitros. Y la albúmina que estoy utilizando es una mezcla uno a uno de albúmina marcada con Texas Red y albúmina no marcada. Así que esta es la preparación en la que voy a mostrarle cómo realizaré la inyección.
Entonces, tengo mi mano izquierda, soy diestro. Con mi mano izquierda me quité el guante para poder colocar un dedo debajo de la oreja y el otro por encima, estirando así la piel para ver exactamente dónde estoy con la aguja y penetrar entre las dos capas de piel en el aire, que es muy delgada. Para ello, utilizo agujas de calibre 27, para tener algo extremadamente delgado que pueda introducirse allí.
Entonces, si lo giro, definitivamente pueden ver dónde fue a parar el Texas red y dónde el PBS. Ahora estamos a 42 horas después del desafío y voy a utilizar un micrómetro con resorte para medir el grosor de la oreja. Voy a medir ambas orejas, la oreja derecha que fue desafiada con la albúmina y la oreja izquierda que no fue desafiada, y la diferencia en el grosor nos dará una idea de la intensidad de la inflamación.
Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 o 58 o 57 o 57. Y el otro oído 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hola. Entonces Christine Beaton acaba de entregarnos la rata que retiró tras medir la respuesta de hipersensibilidad tardía (DTH).
Los hemos transportado aquí sobre hielo. Esta es la oreja izquierda de la rata. Y ahora estamos en el laboratorio de Ian Parker realizando microscopía de dos fotones.
Así que voy a preparar estas orejas para la imagenología por dos fotones in situ. Voy a preparar una de las orejas de la rata aquí en la base de la oreja. El tejido es mucho más grueso y tenemos algunos pelos que sobresalen, lo que será un poco problemático si simplemente comienzo a cortarlo.
Lo primero que voy a hacer es cortar un poco de ese pelo. Estoy sosteniendo suavemente la oreja. Mi dedo facilita mucho el control del tejido cuando lo sostienes entre el pulgar y el índice.
Yo prefiero hacerlo con los dedos en lugar de usar pinzas, porque con las pinzas no siento tan fácilmente lo que está haciendo el tejido, y siempre tenemos la preocupación de dañarlo. Por eso queremos poder sentir lo que estamos haciendo con él. Por eso me gusta más usar los dedos.
Esta es la capa dérmica que se desprende aquí en la oreja de la rata. Mientras estaba recortando algo del vello, pude recortar suavemente parte de esa dermis que simplemente se desprende. Hay unas tijeras de disección muy pequeñas para hacerlo, solo unas tijeras curvas adecuadas.
No querrá pinchar el tejido; puede avanzar desde la base de la oreja hacia la parte superior, cortando suavemente algunas capas dérmicas. No necesitamos una ventana muy grande para la obtención de imágenes. Esta zona justo aquí será suficiente para obtener algunas imágenes nítidas de las células que infiltran el tejido.
Como puede ver, aún tenemos algunos vasos sanguíneos intactos en la base de la oreja y prácticamente a lo largo de toda la punta de la oreja. Toda esta área será muy adecuada para la obtención de imágenes del DTH. Así que procederé a cortar ese fragmento de tejido que he expuesto para obtener un pequeño trozo de tejido que podamos pegar en nuestra platina de imagen.
Así que haga un corte aquí, dale la vuelta. Puedo cortar aquí. Tenemos un pequeño trozo de tejido que podemos preparar en nuestro microscopio de dos fotones para la obtención de imágenes.
Estos son cubreobjetos de plástico irrompibles que cortamos al tamaño de nuestro tejido. Luego montamos el tejido sobre estos utilizando el bet bond. A continuación, fijamos estos cubreobjetos de plástico irrompibles con grasa de silicona a la platina de imagenología in situ.
Voy a tomar este pequeño trozo de tejido aéreo, que tiene una ligera curvatura, así que tendré que aplanarlo mientras lo pego. No es ideal, pero funcionará. Así que toma uno de estos cubreobjetos y lo cortas, estimando más o menos el tamaño de tu oreja, y lo cortas un poco más grande de lo que crees que será.
Para montar nuestro tejido sobre la laminilla, utilizamos un pegamento superfuerte seguro para tejidos llamado bet long. Lo obtenemos de 3M y simplemente colocamos unas cuantas gotas sobre nuestra laminilla.
No quiero tener demasiado. Y también debes asegurarte de que se distribuya de manera uniforme. Así que voy a tomar un pequeño trozo de papel para lentes y usar la esquina de este para absorber y extender el pegamento sobre el cubreobjetos aquí.
Voy a aplicar un poco más de pegamento y, tan pronto como este pegamento entre en contacto con el agua, se curará. Por lo tanto, debes tener mucho cuidado con tu muestra de tejido. Así que voy a tomar la esquina del tejido aquí, que probablemente no vamos a imaginar porque está en la parte curva.
Voy a secarlo un poco. La parte inferior, simplemente sobre el papel para lentes, para que quede completamente seca. Y voy a tocar con la esquina, este tejido de oreja de rata, con la laminilla.
Y debería curarse inmediatamente donde lo he tocado. El resto, simplemente voy a aplanarlo un poco presionando suavemente sobre los bordes. Así, esperamos poder obtener un buen marco de imagen.
Ahora voy a proceder a curar el pegamento sumergiéndolo en medio. Para evitar que el pegamento quede sobre el tejido, lo giramos boca abajo y lo sumergimos lentamente, introduciendo primero una esquina en nuestro depósito de medio; de este modo debería adherirse adecuadamente y podremos observarlo en nuestra cámara de imagen en tejido. Ahora vamos a montar el fragmento de tejido que preparamos para la obtención de imágenes in situ, es decir, el trozo de tejido de cerveza, sobre la platina.
Aquí tenemos nuestro fragmento de tejido con la grasa de silicona en su parte inferior, y simplemente lo colocamos suavemente en el flujo del medio. Ahora está adherido al fondo del portaobjetos mediante la grasa de silicona. Aumente el flujo del medio con nuestra sonda de temperatura justo al lado.
Y ahora vamos a enfocar. Así que voy a encender nuestra luz de enfoque, nuestra luz brillante. Voy a tomar nuestro objetivo de 20 x y bajarlo dentro de la cámara.
Asegúrese de que no toque el tejido. Observe a través del ocular y enfoque el tejido de la oreja. Y ahí está.
Aquí se observan folículos pilosos verdes autofluorescentes en la capa dérmica de la oreja de la rata. Rodeando estos folículos pilosos hay una capa densa de colágeno. Esta es una capa que eliminamos para la imagen de foton T de las células de memoria T fectoras.
Los folículos pilosos autofluorescentes ocultarán la imagen, al igual que el colágeno brillante de la capa dérmica superior. Bien, aquí puede observarse que tenemos APC que han incorporado volín conjugado con rojo Texas, y que están alojadas a lo largo de estas fibras de colágeno azules. Las fibras de colágeno aparecen azules debido a la generación de segundo armónico que obtenemos en la imagen por fotones a lo largo de las fibras de colágeno.
Tenemos linfocitos T altamente móviles. Se desplazan hacia arriba y hacia abajo por las fibras de colágeno e interactúan con las APC. En este video, vio a la Dra. Christine Beaton inducir una DTH adoptiva en la rata Lewis.
Luego les hemos mostrado nuestra preparación de la oreja para la obtención de imágenes, las células de memoria T efectoras responsivas, y la oreja de rata junto con nuestras técnicas de dos fotones para realizarlo.
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Resumen
Este artículo demuestra un método para inducir y registrar reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en la oreja de la rata, seguido de la preparación del tejido de la oreja de la rata para la obtención de imágenes por microscopía de dos fotones de las respuestas de las células T.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Neurociencia
- Biofísica
Antecedentes
- La hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una respuesta inmunitaria clave.
- Comprender la dinámica de las células T es fundamental para la investigación inmunológica.
- La microscopía de dos fotones permite la obtención de imágenes in situ de las respuestas celulares.
- Los modelos con ratas se utilizan comúnmente para estudiar las respuestas inmunitarias.
Objetivo del estudio
- Inducir y registrar reacciones de hipersensibilidad tardía en orejas de ratas.
- Visualizar poblaciones de linfocitos T efector y de memoria.
- Mejorar la comprensión del comportamiento de los linfocitos T in vivo.
Métodos Utilizados
- Inducción de la HRT en el tejido auricular de ratas.
- Inyección de linfocitos T marcados con GFP.
- Microscopía de dos fotones para la obtención de imágenes.
- Análisis in situ de las respuestas de los linfocitos T.
Resultados principales
- Inducción exitosa de la HRT en el modelo de oreja de rata.
- Visualización de poblaciones de linfocitos T mediante microscopía de dos fotones.
- Conocimientos sobre la dinámica de las respuestas inmunitarias in vivo.
- El método demostrado puede aplicarse a estudios inmunológicos adicionales.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar las reacciones de hipersensibilidad tardía.
- La imagenología de dos fotones es efectiva para observar el comportamiento de las células T.
- Esta investigación contribuye al entendimiento de las respuestas inmunitarias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la visualización directa de la dinámica de las células T de memoria efectora en una respuesta inmunitaria específica de tejido, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas en inmunología. Al combinar la inducción adoptiva de la reacción de hipersensibilidad tardía (DTH) con imágenes de dos fotones, proporciona datos cuantitativos con resolución espacial sobre la motilidad de las células T y las interacciones con las células presentadoras de antígenos. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular el comportamiento celular con resultados inmunitarios funcionales en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la visualización in vivo del reclutamiento y activación de linfocitos T efector/memoria CCR7-.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas inmunomoduladoras mediante la observación directa de las interacciones entre linfocitos T y células presentadoras de antígenos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al correlacionar los patrones de motilidad de los linfocitos T con la intensidad inflamatoria en un sistema relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara explantes de tejido estandarizados para obtener imágenes consistentes y reproducibles de la dinámica de las células inmunitarias.
- Valor operativo: Establece una plataforma para lecturas cuantitativas, como el seguimiento celular, la frecuencia de interacciones y la profundidad de infiltración.
- Escalabilidad: Utiliza tejido auricular mínimamente procesado, compatible con protocolos de imagen de alta resolución.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia inmunológica al preservar la arquitectura tisular nativa y las interacciones entre células durante la obtención de imágenes.
- Valor operativo: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al permitir el seguimiento longitudinal de las respuestas inmunitarias en el mismo modelo.
- Reducción de riesgos: Disminuye la ambigüedad mecanicista en la identificación de candidatos principales al proporcionar evidencia directa del acoplamiento al blanco en el tejido.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, permitiendo la refinación iterativa de candidatos inmunomoduladores basada en el comportamiento en tiempo real de las células inmunitarias.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la visualización de las respuestas de las células T ante el desafío con antígeno en un modelo controlado de reacción de hipersensibilidad tardía (DTH).
- Selección: Proporciona preparaciones de tejido listas para ensayos, con espesor y montaje estandarizados, para obtener imágenes reproducibles mediante microscopía de dos fotones.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos que incluyen la velocidad celular, la longitud de las trayectorias y la distribución espacial respecto al colágeno y a las células presentadoras de antígenos (APC).
- Investigación Traducional: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, utilizando el mismo modelo de rata tanto para la inducción como para la obtención de imágenes.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de obtención de imágenes reutilizable, aplicable a múltiples dianas en inmunología y líneas de células T específicas para antígenos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una reducción de riesgos mecanicista mediante la visualización directa de la función de las células T de memoria efectora en el tejido.
- Valor operativo: Estandariza la preparación del tejido y las condiciones de imagen para mejorar la reproducibilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al vincular la dinámica de las células T con resultados inflamatorios en un modelo predictivo.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo al validar los efectos del blanco sobre el comportamiento de las células inmunitarias antes de realizar estudios in vivo costosos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en transferencia adoptiva de linfocitos T, inducción de reacción de hipersensibilidad tardía (DTH) y microscopía de dos fotones.
- Depende del acceso a microscopios de dos fotones con capacidad de generación de segundo armónico para la visualización del colágeno.
- Necesita protocolos estandarizados de manejo de tejidos para garantizar un montaje consistente y la viabilidad durante la adquisición de imágenes.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método de preparación auricular a otros tipos de tejidos o modelos de enfermedad.
- Está limitado por la necesidad de líneas de linfocitos T específicas para el antígeno y controles adecuados para distinguir la inflamación específica de la inespecífica.
