Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Con el fin de estudiar las interacciones del ADN de la cromatina que gobiernan la expresión génica neuronal específica en el cerebro humano, primero se debe obtener una población pura de núcleos neuronales para hacer esto. El tejido cerebral humano postmortem se homogeneiza y los núcleos totales se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad. A continuación, los núcleos se marcan con anticuerpos neuronales específicos aislados mediante clasificación métrica de flujo y, finalmente, se concentran con ultracentrifugación.

Hola, soy Anish Matan del laboratorio de la Dra. Sharon mc Barian aquí en el departamento de psiquiatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts. Hoy les mostraré un procedimiento para el aislamiento de núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post mortem. Así que comencemos.

Para cada muestra de núcleo que se va a clasificar, comience con mil miligramos de tejido cerebral postmortal congelado. Con esta cantidad, se pueden obtener unos 5 millones de núcleos neuronales después de la clasificación activada por fluorescencia. Para comenzar la extracción de los núcleos, coloque 250 miligramos de tejido cerebral en un plumón que contenga cinco milésimas de pulgada de tampón de lisis y colóquelo en hielo.

Una vez que el tejido se descongela, se descongela durante un minuto mientras está en hielo. Después del derribo, transfiera el tejido homogeneizado a un tubo ultracentrífugo transparente de 15 milésimas de pulgada y luego coloque el tubo en hielo. Repita esta homogeneización para el tejido restante.

A continuación, pipetee cuidadosamente nueve milésimas de pulgada de solución de sacarosa en el fondo de los tubos de ultracentrífuga para establecer un gradiente de concentración tal que la solución de tejido homogeneizada esté encima de la solución de sacarosa. Ahora pese los tubos de ultracentrífuga para asegurarse de que estén equilibrados durante la ultracentrifugación. Realice cualquier ajuste en el peso agregando tampón de lisis a la capa superior Después de pesar los tubos, colóquelos en la ultracentrífuga utilizando las muestras de ultracentrífuga del rotor SW 28 a 107163.6 RCF durante 2.5 horas a cuatro grados.

Una vez completada la centrifugación, aspire la nariz y la capa de residuos que se encuentran en el gradiente de concentración. Tenga cuidado de no tocar el pellet en la parte inferior del tubo, que contiene los núcleos. A continuación, agregue 500 microlitros de un XPBS a cada pellet y déjelo reposar sobre hielo durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, vuelva a suspender los gránulos pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La incubación en hielo permite que los gránulos se disuelvan un poco por sí solos, lo que facilita la resuspensión de los núcleos, disminuyendo así la cantidad de estrés que experimentan los núcleos. A continuación, transfiera la suspensión y los núcleos a dos tubos de centrífuga mil.

Combine la solución nucleica de dos de los tubos ultracentrados a cada tubo microcentrífico y, de nuevo, coloque las muestras en hielo. Ahora que se ha completado la extracción nucleica, voy a pasar a la etapa de inmunotinción para aislar los núcleos neuronales de hecho, la clasificación de la muestra que contiene los núcleos se incubará con una mezcla de inmunotinción compuesta por anticuerpo primario y secundario, así como enlaces de bloqueo para hacer la mezcla de inmunotinción a 1,2 microlitros de anticuerpo neuronal específico nuevo N a 300 microlitros de un XPBS. A continuación, añada cien microlitros de mezcla de bloqueo, que contiene un 0,5% de BS, A y un 10% de suero de código normal en un XPBS.

Por último, añade un microlitro del anticuerpo secundario llamado LOR 4 88. Prepare también una tinción inmunológica para obtener una muestra de control negativa para esta mezcla de tinción inmunológica. Excluya el nuevo extremo del anticuerpo primario y reemplácelo con 1,2 microlitros de un XPBS.

Ahora mezcle las mezclas de inmunotinción de vórtice e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad mientras se incuban las mezclas de tinción. Prepare las muestras de núcleos de control para la muestra de control negativo Eloqua 20 microlitros de los núcleos de resus span en un tubo de dos milésimas de pulgada que contiene 980 microlitros de un XPBS. Prepare también un control sin teñir, que contenga la solución de los núcleos y el PBS solamente.

Ahora Eloqua coloca 20 microlitros de los núcleos en otro tubo y eleva el volumen hasta un milésimo de pulgada con un XPBS. A continuación, vuelva a colocar todas las muestras en hielo. A estas alturas, las mezclas de inmunotinción están terminadas.

Incubación: agregue 401 microlitros de la mezcla en la muestra apropiada. La muestra de núcleos recibió la mezcla que contenía tanto nuevos como LOR 4 88. La muestra de control negativa recibió una mezcla que contenía solo el anticuerpo secundario LOR 4 88, mientras que no se añade ninguna tinción inmunológica a la muestra de control no teñida.

A continuación, transfiera las muestras al coldron y gírelas en la oscuridad durante 45 minutos. Ahora que se ha completado la incubación de 45 minutos, llevaré las muestras a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts para realizar una clasificación activada por fluorescencia. Durante el transporte a la instalación central, las muestras deben mantenerse en hielo y en la oscuridad. En la instalación central de citometría de flujo, las muestras se filtran primero a través de un filtro de 40 micras y luego se pasan a través del instrumento durante unos minutos mientras se mantienen frías.

Esto se hace para obtener algunos datos preliminares antes de ordenar. El testigo sin tinción establece el grado de fluorescencia negativa. En función de esta información, ajuste la sensibilidad de la máquina a la fluorescencia.

El control teñido se utiliza para controlar la gripe. Cualquier ruido de fondo debido a la falta de fluorescencia en este punto establece las puertas apropiadas necesarias para la clasificación. Se utilizan varias puertas diferentes para clasificar las muestras.

Estos son algunos datos típicos de la primera puerta. Este gráfico de análisis de fax muestra una muestra representativa después de que se haya ajustado la puerta. La primera puerta reconoce patrones de escombros y núcleos viables en función de una combinación de entornos, como la fluorescencia y la experiencia visual general.

El eje x representa la dispersión directa, que corresponde al tamaño relativo, mientras que el eje Y representa la dispersión del sitio, que tiene en cuenta la complejidad interna, como la granularidad. La primera puerta también puede dar una idea del tamaño de los diferentes núcleos que se encuentran dentro de nuestra muestra. Esto permite separar los escombros de los núcleos reales, y aquí hay algunos datos típicos de la segunda puerta.

Este gráfico de fax muestra un ejemplo de una segunda puerta, que permite ordenar los núcleos individualmente mientras se descartan los agregados. Esta puerta observa las diferencias en los períodos de tiempo que tardan los núcleos en atravesar el láser. Los que son agregados normalmente tardan más en pasar.

Este parámetro en particular es muy importante ya que la inclusión de agregados puede interferir con la pureza, ya que algunos núcleos fluorescentes pueden estar unidos a otros no fluorescentes. Finalmente, aquí están los datos típicos de la tercera puerta. Esta puerta se establece en una longitud de onda de fluorescencia específica que coincide con la del fluorón que se encuentra en nuestro anticuerpo secundario.

En este gráfico de fax, verá el nivel de fluorescencia a lo largo del eje x y un detector de canal de color rojo intenso, PECY siete a lo largo del eje Y. Estas manchas de puntos proporcionan una mejor visualización cuando se comparan simplemente con un histograma de un solo color. La colocación de SCADA permite clasificar y separar los núcleos neuronales nuevos y positivos de los núcleos no neuronales nuevos y negativos.

Una vez elegidas todas las puertas, los núcleos se clasifican en un XPBS. Una vez que toda la muestra haya pasado por la clasificación de hechos, verifique la pureza de la clasificación pasando un Eloqua de la muestra clasificada a través del instrumento. Este es un ejemplo de un resultado óptimo.

Aquí se compara la muestra preclasificada, que contiene una población mixta de los núcleos, con el Eloqua ordenado que ha eliminado la mayoría de los núcleos negativos. Tenga en cuenta que los porcentajes de pureza se basan en el número de eventos que contaminan la muestra en función de las puertas que se establecieron. Tenga en cuenta que la primera vez que la muestra se pasa por la máquina, puede producirse algún blanqueo, lo que provoca cierta oscurecimiento. Para tener en cuenta esto, es posible que sea necesario realizar algunos ajustes.

Una vez que se haya clasificado la muestra, comience a procesar los núcleos. Para hacer esto, tome 10 milésimas de pulgada de la muestra clasificada y agregue dos milésimas de pulgada de solución de sacarosa, 50 microlitros de cloruro de calcio molar y 30 microlitros de acetato de magnesio molar. Si hay menos de 10 milésimas de pulgada de muestra clasificada, aumente el volumen hasta 10 milésimas de pulgada agregando un XPBS o ajuste los materiales adicionales en consecuencia.

A continuación, invierta la muestra varias veces y colóquela en hielo durante 15 minutos. Después de 15 minutos, la centrífuga muestra en un rotor de cangilón oscilante 1, 786 RCF durante 15 minutos a cuatro grados. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la bolita blanca que se encuentra en el fondo del tubo.

A continuación, disuelva el pellet en 200 microlitros de la solución adecuada necesaria para los experimentos anteriores. En este caso, estamos disolviendo el pellet y el tampón de caída para el posterior experimento de chips. A continuación, vuelva a suspender el pellet por un tubo hacia arriba y hacia abajo.

En este punto, puede transferir los núcleos a un tubo más pequeño y colocarlo en un congelador a menos 80 grados Celsius. Hasta nuevo uso, bueno, acabo de mostrarte cómo aislar núcleos neuronales del tejido cerebral humano post mortem. Con estos núcleos, se pueden llevar a cabo una serie de análisis diferentes, como la inmunoprecipitación de cromatina.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe mantener sus muestras en hielo, ya que el nuclear no está fijado y puede degradarse a temperatura prolongada. Además, es importante manipular tejido humano con estándares de seguridad de bioseguridad de nivel dos o superiores. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.