Name: Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a aislar núcleos neuronales de tejido cerebral humano post-mortem mediante homogeneización, centrifugación en gradiente de densidad y citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar interacciones cromatínicas y expresión génica neuronal con alta pureza.

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Los autores agradecen el asesoramiento y apoyo técnico proporcionado por el Dr. Richard Konz y el personal en las instalaciones de flujo básico de Citometría de la Universidad de Massachusetts Medical School. Los recursos básicos con el apoyo de la Diabetes Endocrinología del Centro de Investigación de Grant DK032520 también fueron utilizados. Este trabajo es apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH), el Instituto Nacional de Abuso de Drogas (NIDA) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano.

Los núcleos de extracción <ol><li> Poner 250 mg de tejido congelado el cerebro post mortem en 5 ml de un tampón de lisis en un douncer y colocarlo sobre hielo. Para recibir unos 5 millones de núcleos después de FACS clasificación, por lo general el uso de 1000 mg de tejido por muestra. </li><li> Una vez que el tejido se ha descongelado, el tejido Dounce durante 1 minuto, mientras que en el hielo. </li><li> Tome el tejido homogeneizado y colocarlo en un tubo de ultracentrífuga 15 ml claro. Ponga el tubo en hielo. </li><li> Tomar 9 mL de solución de sacarosa 2 con una pipeta, poner la pipeta en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga claro, y liberar la solución de sacarosa 2 para crear un gradiente de concentración con la solución de tejido homogeneizado en la parte superior de la solución de sacarosa 2. </li><li> Pesar los tubos de ultracentrífuga para asegurarse de que todos ellos serán equilibradas al girar dentro de la ultracentrífuga. Realizar ajustes en el peso mediante la adición de un tampón de lisis a la capa superior. </li><li> Después de que los tubos han sido pesados, colocarlos en cubos del rotor. </li><li> Coloque todos los cubos en un rotor SW28 y coloque cuidadosamente el rotor en la ultracentrifugación. </li><li> Ultracentrífuga las muestras a 107.163,6 RCF durante 2,5 horas a 4 ° C. </li><li> Una vez se haya completado la centrifugación, separar el sobrenadante, junto con la capa de desechos que se encuentran en el gradiente de concentración, con el uso de un vacío, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento que contiene los núcleos en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 500 l de PBS 1X a cada pastilla y deje reposar en hielo durante 20 minutos. Esto permite que la pastilla se disuelva un poco por su cuenta, lo que facilita que se disuelva después mecánicamente pipeteando arriba y hacia abajo, lo que disminuye la cantidad de estrés la experiencia de los núcleos. </li><li> Después de los núcleos que se incubó en hielo durante 20 minutos, mecánicamente pipeta hacia arriba y abajo, para disolver completamente los núcleos dentro de 1XPBS. </li><li> Eliminar la solución de los núcleos que contienen los tubos de ultracentrífuga y combinar el contenido de dos tubos en un solo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Una vez más, el lugar de las muestras en hielo. </li></ol> La inmunotinción para FACS <ol><li> En este punto, hacer una mezcla compuesta por inmunotinción de anticuerpos primaria y secundaria, y el bloqueo de la mezcla. Para cada muestra, se combinan 300 L de 1XPBS que contiene 1,2 l de anticuerpos NeuN, 100 l de mezcla de bloqueo, que contiene 0,5% de BSA y el 10% suero normal de cabra en 1XPBS, y 1 l de Alexa Fluor 488. Para las muestras de control, excluye la NeuN anticuerpo primario y, en cambio, sólo tiene que añadir más 1XPBS. </li><li> Vortex la mezcla inmunotinción e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Mientras que la mezcla de tinción se está incubando, que los controles de las muestras. Por FACS clasificación, una muestra que contiene núcleos solo, llamado el &quot;control sin mancha&quot; es necesario, una segunda muestra, un control negativo, que contiene el núcleo con el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 sin NeuN anticuerpo primario es también necesaria. </li><li> Alícuota de 20 l de los núcleos que contiene la solución en un tubo de microcentrífuga de 2 ml contiene 1XPBS para el control de mancha, y otro 20 l en otro tubo de 2 ml que contiene 980 l de 1XPBS para el control negativo. Aumentar el volumen de los núcleos que contienen una copia de seguridad muestra a 1 ml con 1XPBS. Todas las muestras se colocan de nuevo en hielo. </li><li> Ahora que la mezcla de inmunotinción ha terminado la incubación, añadir su contenido de 401 l en la toma de muestras adecuadas. La muestra de núcleos recibirá la mezcla que contiene tanto NeuN y Alexa Fluor 488, mientras que la muestra negativa recibirá la mezcla que sólo contenga el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488. </li><li> Tomar las muestras en la cámara frigorífica para girar en la oscuridad durante 45 minutos. </li><li> Después de las muestras se han incubado en la oscuridad durante 45 minutos, los ponen en hielo y llevarlos al centro de FACS. Durante el transporte a las instalaciones de la FACS, las muestras deben mantenerse en hielo y en la oscuridad. </li></ol> FACS <ol><li> En las instalaciones de la FACS, filtro de las muestras a través de un filtro de 40 um. A continuación, ejecutar a través del instrumento durante unos minutos, mientras que se mantiene frío, con el fin de obtener algunos datos preliminares antes de la clasificación. </li><li> En este punto, es necesario establecer las puertas apropiadas requeridas para la clasificación. Varias puertas se utilizan diferentes a las muestras de clase. La primera puerta da una idea del tamaño de los núcleos diferentes que se encuentran dentro de la muestra, y permite separatation de escombros de los núcleos actuales. La segunda puerta que nos permite ordenar los núcleos de forma individual. Deseche todos los agregados se descartan en este momento. Por último, la tercera puerta está establecido en una longitud de onda de fluorescencia específica, igual a la del fluorocromo en nuestro anticuerpo secundario. La colocación de esta puerta que nos permite clasificar y separar NeuN +, por lo tanto, los núcleos neuronales de NeuN - núcleos. </li><li> Después de todas las puertas son elegidos, los núcleos se pueden clasificar en 1XPBS. </li><li> Una vez que eltotalidad de la muestra ha pasado, comprobar la pureza de la especie mediante la ejecución de una parte alícuota de la muestra ordenados a través del instrumento. Asegúrese de que la fluorescencia de la muestra no es hacia fuera, sino que está contenido en un solo cuadrante. Lo mejor es elegir las muestras que son más del 90% de pureza. </li></ol> Después de FACS <ol><li> Una vez que la muestra ha sido ordenada, el procesamiento de los núcleos puede comenzar. Tomar 10 ml de muestra ordenados y añadir a 2 ml de solución de sacarosa 2, 50 uL de 1 M de CaCl 2 y 30 ul de 1m Mg (As) 2. Como recordatorio, siempre asegúrese de mantener la muestra en hielo desde los núcleos son fijadas. </li><li> Si hay menos de 10 ml de muestra ordenada, subir el volumen hasta 10 ml mediante la adición de 1XPBS, o ajustar los materiales adicionales en consecuencia. </li><li> Invertir la muestra en varias ocasiones y el lugar en hielo durante 15 minutos. </li><li> Después de que las muestras han incubaron en hielo durante 15 minutos, los de centrifugación en un rotor basculantes a 1786 rcf durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante con el uso de un vacío, sin perturbar el precipitado blanco en la parte inferior del tubo. </li><li> Disolver el precipitado en 200 l de cualquier solución que usted requiere para los experimentos de procedimiento, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> La transferencia de la solución en un tubo más pequeño y colocarlo en el congelador de -80 º C hasta su uso posterior. </li></ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

El protocolo que aquí se presenta debe ser particularmente útil para los estudios se centraron en los cambios epigenéticos de la cromatina neuronal y, en general, sobre el fenotipo molecular del núcleo neuronal, durante el funcionamiento normal desarrollo de la enfermedad y el envejecimiento, o neurológicos o psiquiátricos. El método es particularmente ventajoso cuando la heterogeneidad celular del tejido cerebral, incluyendo posibles cambios en la ración de las neuronas a células gliales en el transcurso del tiempo ya causa de la enfermeda...

Reactivos: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Tampón de lisis </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Sacarosa </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl2 </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 l </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 l </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuste el volumen a 50 ml con agua esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solución de sacarosa </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sacarosa </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 l </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 l </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuste el volumen a 50 ml con agua esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce buffer </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar el pH a 7.5 y el volumen a 200 ml con agua esterilizada </td></tr></table>

aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Las neuronas en el cerebro humano se postmitóticas en gran parte durante el desarrollo prenatal, y así mantener sus núcleos en todo el ciclo de vida completo. Sin embargo, poco se sabe acerca de los cambios en la cromatina nuclear y la organización neuronal durante el curso del desarrollo y el envejecimiento, o en las enfermedades neuropsiquiátricas crónicas. Sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los ensayos basados ​​en la cromatina y el ADN (excepto los de pescado) Resolución de la falta de células individuales. Con este fin, la gran heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante, ya que por lo general diversas subpoblaciones de neuronas se entremezclan con los diferentes tipos de glía y otras células no neuronales. Una posible solución sería hacer crecer células de tipo culturales específicas, pero la mayoría de las células del SNC, incluyendo las neuronas, son ex vivo sostenible, en el mejor de los casos, sólo un par de semanas y por lo tanto proporcionaría un modelo incompleto de los mecanismos epigenéticos potencialmente operan en todo el ciclo de vida completo . Aquí, ofrecemos un protocolo para extraer y purificar los núcleos de congelación (no fijos) del cerebro de cadáver. El método consiste en la extracción de núcleos en solución amortiguadora de lisis hipotónica, seguida por ultracentrifugación y immunotagging con anticuerpos anti-NeuN. Núcleos etiquetados neuronal continuación, se recogen por separado mediante fluorescencia activadas por la clasificación. Este método debe ser aplicable a cualquier región del cerebro en una amplia gama de especies y adecuada para los estudios de inmunoprecipitación de la cromatina en el sitio-y la modificación de los anticuerpos específicos anti-histonas, y por la metilación del ADN y otros ensayos.

La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Las neuronas del cerebro humano se vuelven postmitóticas principalmente durante el desarrollo prenatal y, por lo tanto, mantienen sus núcleos a lo largo de toda la vida. Sin embargo, ...

Con el fin de estudiar las interacciones entre el ADN y la cromatina que regulan la expresión génica específica de las neuronas en el cerebro humano, primero debe obtenerse una población pura de núcleos neuronales para realizar esto. El tejido cerebral humano postmortem se homogeniza y los núcleos totales se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad. Luego, los núcleos se marcan con anticuerpos específicos de neuronas y se aíslan mediante clasificación citométrica de flujo, y finalmente se concentran mediante ultracentrifugación.Hola, soy Anish Matan del laboratorio de la Dra. Sharon mc Barian, en el departamento de psiquiatría de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts. Hoy les mostraré un procedimiento para el aislamiento de núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano postmortem. Comencemos.Para cada muestra de núcleos que se va a clasificar, comience con mil miligramos de tejido cerebral postmortem congelado. Con esta cantidad, puede obtener aproximadamente 5 millones de núcleos neuronales tras la clasificación activada por fluorescencia. Para iniciar la extracción de núcleos, coloque 250 miligramos de tejido cerebral en un douncer que c

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un procedimiento que utiliza láser microdisección de captura para aislar y extraer el ARN de una población celular homogénea, las neuronas piramidales en la capa III de la circunvolución temporal superior en los cerebros humanos postmortem. Estamos posteriormente amplifican linealmente (T7-based) mRNA, y se hibridan la muestra a la Affymetrix humanos X3P microarrays.

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

Núcleos están aislados cardíaca a través de la sedimentación y la densidad de immunolabeled con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar y clasificar los núcleos de cardiomiocitos mediante citometría de flujo.

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Este video describe el protocolo para aislar núcleos individuales de tejido de glioma fresco congelado. Los núcleos individuales aislados se pueden utilizar como muestras para técnicas de secuenciación como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA) y el ensayo de un solo núcleo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATAC) para obtener una visión más profunda de la heterogeneidad inter e intratumoral observada en el glioma de los tejidos nerviosos centrales.

Aislamiento de núcleos de tejidos frescos congelados de glioma: un método para obtener núcleos intactos a partir de muestras de tumores de glioma

El video muestra un método para aislar núcleos intactos de células gliales y madre en el giro dentado (DG) del hipocampo del ratón. El tejido DG se disocia mecánicamente en un tampón de homogeneización en frío para liberar los núcleos. Los restos de tejido y otros orgánulos liberados se descartan, y los núcleos se tiñen con una tinción de ADN y un anticuerpo conjugado con fluoróforos específico para el antígeno nuclear neuronal (NeuN). A continuación, se emplea la clasificación de núcleos...

Una técnica para aislar núcleos de células no neuronales en el giro dentado del hipocampo

Este video muestra el procedimiento para aislar y clasificar núcleos de tejido cerebral humano recién congelado utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), que permite el estudio de diferentes poblaciones celulares para diversas aplicaciones neurológicas.

Aislamiento de poblaciones celulares del tejido cerebral mediante la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.

Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq

Hemos desarrollado un método que enriquece y aísla poblaciones de astrocitos humanos a partir de tejido fresco congelado para su uso en análisis moleculares posteriores.

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.

Preparación de núcleos cerebrales y de médula ósea de alta calidad para ensayos multioma de núcleos individuales

Aprende a aislar núcleos neuronales de tejido cerebral humano post-mortem mediante homogeneización, centrifugación en gradiente de densidad y citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar interacciones cromatínicas y expresión génica neuronal con alta pureza.

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

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