Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Con el fin de estudiar las interacciones entre el ADN y la cromatina que regulan la expresión génica específica de las neuronas en el cerebro humano, primero debe obtenerse una población pura de núcleos neuronales para realizar esto. El tejido cerebral humano post mortem se homogeniza y los núcleos totales se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad. Luego, los núcleos se marcan con anticuerpos específicos de neuronas aislados mediante clasificación citométrica de flujo y, finalmente, se concentran mediante ultracentrifugación.

Hola, soy Anish Matan del laboratorio de la Dra. Sharon mc Barian, en el departamento de psiquiatría de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts. Hoy les mostraré un procedimiento para el aislamiento de núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post mortem. Comencemos.

Para cada muestra de núcleos que se va a clasificar, comience con mil miligramos de tejido cerebral post mortem congelado. Con esta cantidad, puede obtener aproximadamente 5 millones de núcleos neuronales tras la clasificación activada por fluorescencia. Para iniciar la extracción de núcleos, coloque 250 miligramos de tejido cerebral en un homogeneizador Dounce que contenga cinco mililitros de tampón de lisis, y colóquelo en hielo.

Una vez que el tejido se descongele, enfríelo durante un minuto sobre hielo. Después de este periodo, transfiera el tejido homogenizado a un tubo transparente de ultracentrífuga de 15 ml y coloque el tubo sobre hielo. Repita esta homogenización con el tejido restante.

A continuación, pipetee cuidadosamente nueve mililitros de solución de sacarosa hasta el fondo de los tubos de ultracentrífuga para establecer un gradiente de concentración, de modo que la solución de tejido homogenizado quede encima de la solución de sacarosa. Ahora pese los tubos de ultracentrífuga para asegurarse de que estén equilibrados durante la ultracentrifugación. Realice los ajustes de peso añadiendo tampón de lisis a la capa superior. Una vez pesados los tubos, colóquelos en la ultracentrífuga utilizando el rotor SW 28 y centrifugue las muestras a 107163,6 RCF durante 2,5 horas a cuatro grados.

Una vez finalizada la centrifugación, aspire el sobrenadante junto con la capa de desechos presente en el gradiente de concentración. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento en el fondo del tubo, que contiene los núcleos. A continuación, agregue 500 microlitros de un XPBS a cada sedimento y déjelo reposar en hielo durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, resuspenda los pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La incubación en hielo permite que los pellet se disuelvan ligeramente por sí solos, lo que facilita la resuspensión de los núcleos y reduce así la cantidad de estrés que experimentan. Luego, transfiera la suspensión y los núcleos a dos tubos de centrífuga de mil.

Combine la solución de ácidos nucleicos de dos de los tubos de ultracentrífuga en cada tubo de microcentrífuga y coloque nuevamente las muestras en hielo. Ahora que la extracción de ácidos nucleicos está completa, voy a pasar al paso de inmunotinción para aislar núcleos neuronales mediante clasificación FACS. La muestra que contiene núcleos será incubada con una mezcla de inmunotinción compuesta por anticuerpos primarios y secundarios, así como mezclas de bloqueo. Para preparar la mezcla de inmunotinción, añada 1,2 microlitros de anticuerpo específico neuronal NeuN a 300 microlitros de PBS 1X. Luego, agregue cien microlitros de mezcla de bloqueo, que contiene 0,5 % de BSA y 10 % de suero normal de cabra en PBS 1X.

Finalmente, agregue un microlitro del anticuerpo secundario llamado LOR 4 88. También prepare una tinción inmunológica para una muestra de control negativo con esta mezcla de inmunotinción. Excluya el anticuerpo primario new end y sustitúyalo con 1,2 microlitros de 1 XPBS.

Ahora vortexar las mezclas de inmunomarcado y incubarlas durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad mientras las mezclas de tinción están incubando. Prepare las muestras de núcleos control para la muestra control negativa: Eloqua 20 microlitros de los núcleos resuspendidos en un tubo de dos mililitros que contiene 980 microlitros de PBS 1X. También prepare un control sin teñir, que contiene solo la solución de núcleos y PBS.

Ahora eluya 20 microlitros de los núcleos a otro tubo y aumente nuevamente el volumen hasta un mil con un XPBS. Luego coloque todas las muestras de regreso en hielo. Para este momento, las mezclas de tinción inmunológica ya han finalizado.

Incubar, añadir 401 microlitros de la mezcla al muestra adecuada. La muestra de núcleos recibió la mezcla que contenía tanto nuevo como LOR 4 88. La muestra de control negativo recibió una mezcla que contenía solo el anticuerpo secundario LOR 4 88, mientras que no se añadió tinción inmunológica a la muestra de control sin teñir.

A continuación, transfiera las muestras al coldron y rote en la oscuridad durante 45 minutos. Ahora que ha finalizado la incubación de 45 minutos, llevaré las muestras al laboratorio central de citometría de flujo de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts para realizar una clasificación activada por fluorescencia. Durante el transporte al laboratorio central, las muestras deben mantenerse sobre hielo y en la oscuridad. En el laboratorio central de citometría de flujo, primero se filtran las muestras a través de un filtro de 40 micrones y luego se analizan en el instrumento durante unos minutos, manteniéndolas frías.

Esto se realiza para obtener algunos datos preliminares antes de la clasificación. El control sin tinción establece el grado de fluorescencia negativa. Con base en esta información, ajuste la sensibilidad del equipo a la fluorescencia.

El control teñido se utiliza para controlar la flu. Cualquier ruido de fondo debido a la fluorescencia en este punto establece las compuertas adecuadas necesarias para la clasificación. Se utilizan varias compuertas diferentes para clasificar las muestras.

Aquí se muestran algunos datos típicos para la primera compuerta. Este gráfico de análisis de fax muestra una muestra representativa después de que se ha ajustado la compuerta. La primera compuerta reconoce patrones de restos y núcleos viables basándose en una combinación de ajustes, como la fluorescencia y la experiencia visual general.

El eje X representa la dispersión directa, que corresponde al tamaño relativo, mientras que el eje Y representa la dispersión lateral, que indica la complejidad interna, como la granularidad. La primera compuerta también puede dar una idea del tamaño de los diferentes núcleos presentes en nuestra muestra. Esto permite separar los restos celulares de los núcleos reales, y a continuación se muestran algunos datos típicos de la segunda compuerta.

Este gráfico de fax muestra un ejemplo de una segunda compuerta, que permite clasificar núcleos individualmente mientras descarta cualquier agregado. Esta compuerta analiza las diferencias en los tiempos que tardan los núcleos en pasar a través del láser. Los que son agregados normalmente tardan más en atravesarlo.

Este parámetro particular es muy importante, ya que la inclusión de agregados puede interferir con la pureza, dado que algunos nucleótidos fluorescentes podrían estar unidos a otros no fluorescentes. Por último, aquí se muestran datos típicos del tercer canal. Este canal se ajusta a una longitud de onda de fluorescencia específica que coincide con la del fluoróforo presente en nuestro anticuerpo secundario.

En este gráfico de fax, se observa el nivel de fluorescencia a lo largo del eje X y un detector de canal rojo profundo, PECY siete, a lo largo del eje Y. Estos puntos ofrecen una representación visual más clara en comparación con un histograma de un solo color. Colocar SCADA permite clasificar y separar núcleos neuronales nuevos y positivos de núcleos no neuronales nuevos y negativos.

Después de seleccionar todas las compuertas, los núcleos se ordenan en un solo XPBS. Una vez que toda la muestra haya pasado por la ordenación, verifique la pureza de la separación realizando un Eloqua de la muestra ordenada mediante el instrumento. A continuación se muestra un ejemplo de un resultado óptimo.

Aquí compare la muestra previa a la clasificación, que contiene una población mixta de núcleos, con el Eloqua clasificado que ha eliminado la mayoría de los núcleos negativos. Tenga en cuenta que los porcentajes de pureza se basan en el número de eventos que contaminan la muestra según las compuertas establecidas. Considere que la primera vez que se analiza la muestra en la máquina, puede ocurrir un cierto blanqueo, lo que provoca un debilitamiento de la señal; para tener esto en cuenta, puede ser necesario realizar algunos ajustes.

Una vez que la muestra haya sido clasificada, comience a procesar los núcleos. Para ello, tome 10 mililitros de la muestra clasificada y agregue 2 mililitros de solución de sacarosa, 50 microlitros de cloruro de calcio 1 M y 30 microlitros de acetato de magnesio 1 M. Si hay menos de 10 mililitros de muestra clasificada, aumente el volumen hasta 10 mililitros añadiendo PBS 1X o ajuste los materiales adicionales en consecuencia.

A continuación, invierta la muestra varias veces y colóquela en hielo durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugue la muestra en un rotor de cubeta oscilante a 1.786 RCF durante 15 minutos a cuatro grados. Tras la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado blanco que se encuentra en el fondo del tubo.

Luego, disuelva el sedimento en 200 microlitros de la solución adecuada necesaria para los experimentos previos. En este caso, estamos disolviendo el sedimento en tampón de dilución para un experimento de chip posterior. A continuación, re suspenda el sedimento pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

En este momento, puede transferir los núcleos a un tubo más pequeño y colocarlo en un congelador a menos 80 grados Celsius. Hasta su uso posterior, bueno, acabo de mostrarle cómo aislar núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano posmortem. Con estos núcleos, puede realizar varios análisis diferentes, como la inmunoprecipitación de cromatina.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener siempre las muestras en hielo, ya que los núcleos están sin fijar y pueden degradarse a temperaturas elevadas. Asimismo, es fundamental manipular los tejidos humanos según las normas de seguridad biológica nivel dos o superiores. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.