Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

En el laboratorio Dowling, estudiamos la fisiología y el desarrollo de la retina en el pez cebra para determinar si los mutantes de pez cebra que son incapaces de detectar movimiento pueden percibir la luz y no son ciegos. Para ello, evaluamos su respuesta motora visual o VMR. Recogemos peces cebra aproximadamente a los cuatro días posteriores a la fertilización.

Colóquelos en placas de 96 pocillos, prepare un sistema adecuado para imágenes, alinee el software de seguimiento de video con la placa y luego registre la respuesta motora de los peces tras las transiciones de luz a oscuridad o de oscuridad a luz, lo que denominamos VMR. Hola, soy Farida Imran del laboratorio de John Dowling y del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Harvard.

Y yo soy Jason Rio. Soy del laboratorio de Alexander Shear, también en el departamento de biología molecular y celular de la Universidad de Harvard. Hoy les mostraremos la respuesta motora visual en el pez cebra frente a incrementos y decrementos de luz.

Así que comencemos. Para iniciar el ensayo de respuesta motora visual, primero cultive larvas de pez cebra silvestres bajo un ciclo oscuro-luz a 28 grados Celsius hasta al menos cuatro días posteriores a la fertilización. Nuestro ciclo típico de luz y oscuridad es de 14 horas con luz encendida a partir de las 9:00 AM y 10 horas con luz apagada a partir de las 11:00 PM para obtener los mejores resultados conductuales.

Evite sobrepoblar las larvas. Normalmente mantenemos no más de 50 larvas en un solo plato de Petri. Cinco días después de la fertilización, transferimos los peces cebra a una placa de 96 pocillos con un tamaño de pocillo de 650 microlitros para proporcionar a las larvas un mayor espacio para nadar.

Utilizando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera suavemente una larva por pocillo. Después de transferir los peces a los pocillos, llene cada uno con suficiente agua para peces de modo que la superficie del agua quede casi al ras de la parte superior de los pocillos. Tenga cuidado de no llenar en exceso ni insuficientemente los pocillos para evitar problemas ópticos para la cámara de grabación.

También tenga cuidado de no introducir burbujas en los pocillos. Ahora los peces están listos para ser monitoreados en cuanto a sus respuestas locomotoras a la luz y la oscuridad. Llevemos los peces cebra en placas al aparato de registro.

Así que procedamos examinando el aparato de grabación. La placa de 96 pocillos que contiene los peces se colocará dentro de la cámara de grabación, aquí en esta bandeja blanca, y se sujetará en su lugar con un resorte o una banda de goma. La cámara está posicionada en la parte trasera de la caja aquí y se enfoca en la placa mediante espejos situados en la parte superior de la caja, ubicados aquí.

El ángulo de estos espejos puede ajustarse girando los tornillos que sujetan los espejos en su lugar. La cámara de grabación se ilumina desde abajo mediante LED infrarrojos. Esto permite que la cámara grabe a los peces incluso en la oscuridad.

Las larvas no pueden detectar la luz IR, por lo que esta iluminación IR constante no afecta el experimento. Los LED blancos también iluminan la cámara de grabación desde abajo. Se controlan por separado de las luces IR para experimentos que duran más de unas pocas horas.

La cámara puede llenarse con agua que fluye suavemente para ayudar a mantener una temperatura constante durante la duración del experimento. El agua es bombeada desde un depósito mediante una pequeña bomba de acuario y se calienta a 28 grados con un calentador acuático subacuático típico. El agua desagua a través de un orificio de drenaje grande y se recircula hacia el depósito para minimizar las vibraciones accidentales provenientes del ambiente.

La unidad de grabación completa se sitúa encima de una mesa de equilibrio pesada. Cuando el aparato de grabación está listo, se utiliza la tapa de una caja para cubrir a los animales y aislarlos aún más de la luz. Ahora procedamos con la alineación del 96.

Placa de pocillos con la cuadrícula computarizada del software de seguimiento de video en primer lugar, coloque la placa de 96 pocillos que contiene los peces dentro de la cámara de grabación. Al utilizar un baño de agua para experimentos a largo plazo, coloque lentamente la placa en el agua, permitiendo que el nivel de agua se ajuste sin derramarse sobre la placa. En el software de seguimiento de video, verifique que todas las larvas y el experimento sean visibles en la pantalla del computador.

Utilizando los controles del software, alinee la cuadrícula del software de seguimiento de video con los pocillos de la placa de 96 pocillos, de modo que cada pez quede dentro de un cuadrado de la cuadrícula. Este paso es muy importante para todas sus grabaciones. La computadora de seguimiento calculará el movimiento por separado para cada uno de estos cuadros.

Por lo tanto, si se desalinea la cuadrícula del ordenador, es posible que algunos movimientos de los peces se pierdan o, aún peor, que dos peces adyacentes ocupen la misma área y se cuenten como un solo pez tras el alineamiento. El momento en que se encenderán y apagarán las luces está programado en el ordenador.

Normalmente permitimos tres horas de adaptación oscura más ligera en la caja. Esto no solo permite obtener un nivel de actividad basal, sino que también brinda a las larvas la oportunidad de calmarse tras la pipetación y manipulación. A continuación, cerramos la puerta de nuestra cámara de grabación e iniciamos la grabación.

En la práctica, registramos la actividad de cada pez por segundo, pero el software de seguimiento en realidad graba los datos cuadro por cuadro. Aquí debajo de la pantalla puede observarse un trazado en tiempo real de un pez individual. En cuanto al movimiento de píxeles, la línea blanca indica que el número de cambios de píxeles está por debajo de un umbral establecido, y el color verde indica que el cambio de píxeles está por encima del umbral configurado.

El valor umbral dependerá en cierta medida de la cámara y la configuración de iluminación específicas que utilice. Para nuestra configuración, normalmente empleamos un umbral de cuatro píxeles. Es decir, si cambian menos de cuatro píxeles, se considera que es fondo.

Si más de cuatro píxeles se están moviendo, indica que el pez se está desplazando. Determinamos empíricamente que este umbral detecta casi todos los movimientos de nado y giro de las larvas. Aunque los recuadros de grabación aíslan bastante bien a las larvas, aún así apagamos la luz de la habitación y tomamos precauciones para minimizar interrupciones con ruidos mecánicos, como abrir y cerrar puertas en la habitación, hacer una fiesta de baile o realizar nuestras rutinas de ejercicio.

Una vez finalizado el experimento, transfiera los datos recopilados a una hoja de Excel o a su programa de análisis favorito. Así es como se ven los datos. Contienen el tiempo en segundos desde el inicio del experimento y la actividad de cada larva por segundo.

Aquí hay un gráfico que muestra la actividad de una larva individual durante toda la duración del experimento, con varias respuestas de encendido y apagado indicadas por las flechas en el gráfico. Este gráfico muestra la actividad promedio de 40 peces durante toda la duración del experimento, con varias respuestas de encendido y apagado indicadas por las flechas. Como puede observarse, las respuestas de encendido y apagado son prominentes y consistentes.

Este experimento de respuesta motora visual también puede realizarse con peces mutantes. Para estos estudios, normalmente colocamos peces de tipo silvestre y peces mutantes en la misma placa, dispuestos en un patrón de tablero de ajedrez para obtener un control óptimo. Cuando se utilizan peces mutantes en la misma placa que peces de tipo silvestre, asegúrese de anotar qué tipo de pez se colocó en cada pocillo.

Aquí hay una sugerencia sobre cómo llevar un registro de los peces colocados en cada pocillo. A continuación se muestran los resultados de la respuesta motora visual, que comparan larvas de tipo silvestre y mutantes. Nuevamente, observamos respuestas claras y consistentes de encendido y apagado en las larvas de tipo silvestre.

Sin embargo, las larvas mutantes chalk, que carecen de desarrollo ocular, no aumentan significativamente su actividad ante incrementos ni decrementos de luz y presentan un nivel basal de actividad bajo. Estos resultados comparan las respuestas del tipo silvestre con las de los mutantes NO OKR, también llamados mutantes NRC. Se pensaba que el mutante NRC era completamente ciego según la prueba de OKR.

Mediante la prueba de respuesta motora visual, demostramos que el mutante NRC presenta una respuesta de apagado normal y una respuesta de encendido retardada y lenta. Por lo tanto, el mutante NRC no es completamente ciego, como se había pensado anteriormente. Acabamos de mostrarles la respuesta motora visual de la raya cebra frente a incrementos y decrementos de luz.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar llevar a cabo el experimento durante el día, ya que los peces son más activos y responden mejor a los cambios en la intensidad de la luz durante el día que durante la noche. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.