Name: Inmunoprecipitación de ADN metilado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Aprende el protocolo MeDIP para aislar ADN metilado de forma imparcial usando anticuerpos anti-5mC. Esta técnica de epigenética permite estudiar patrones de metilación en cáncer y desarrollo.

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Queremos agradecer a los miembros de la Brown y laboratorios de Lam por su participación en la crítica de este video y en el artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Michael Smith Fundación para la Investigación de la Salud.

Extracción de ADN y preparación de muestras ADN de una variedad de diferentes muestras (células cultivadas, fresco congelado, así como tejidos en parafina fijado en formol e incrustados) puede ser utilizado para MeDIP. Es importante usar el ADN altamente purificado sin proteínas asociadas, como las histonas. También es importante para eliminar el ARN tanto como sea posible de la muestra, ya que puede interferir con la cuantificación del ADN y la unión del anticuerpo. La cantidad de ADN utilizado para MeDIP puede variar de 200 ng a 1 mg dependiendo de la cantidad de ADN disponible. Para demostrar este protocolo, 1 ug de ADN se utiliza. El protocolo siguiente se proporciona una alta calidad ADN de doble cadena a partir de células cultivadas. Otros protocolos deben ser empleados para la extracción de ADN de otros tipos de muestras. <ol><li> Añadir 400 l de tampón de digestión a un pellet de células en un tubo de 1,7 ml Eppendorf. </li><li> Añadir 100 mg de proteinasa K en el tubo y se incuban durante la noche a 50 ° C. </li><li> Añadir 500 l de fenol pH 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión. </li><li> Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo. </li><li> Repita los pasos 3 a 5 una vez. </li><li> Añadir 500 l 1:01 pH fenol / cloroformo 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión. </li><li> Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo. </li><li> Agregar 40 g de RNasa A y se incuba 1 hora a 37 ° C. </li><li> Añadir 500 l de fenol pH 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión. </li><li> Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo. </li><li> Repita los pasos 11 a 13 una vez. </li><li> Añadir 500 l 1:01 pH fenol / cloroformo 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión. </li><li> Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo. </li><li> Añadir un volumen 1/10th acetato de sodio 3 M (40 ml) y mezclar bien. </li><li> Agregar 2 volúmenes (900 l) de etanol al 100%, mezcle bien y coloque a -20 ° C durante 20 minutos. </li><li> Giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar el etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual. </li><li> Añadir 500 l de etanol 70% frío para lavar. Giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar 70% de etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual con pipeta. </li><li> Deje secar al aire el precipitado con la tapa abierta durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de etanol residual. </li><li> Resuspender el ADN en 50 l de dH2O esterilizado la noche a 4 ° C. </li><li> Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Un 260: Una relación de 280 de 1.8 es ideal. </li><li> Determinar la calidad del ADN y el rango de tamaño en un gel de agarosa con escalera de 100 pb. Tan poco como 10 ng de DNA genómico se puede ejecutar en un 1,7% en gel de agarosa seguida de tinción con un colorante que es muy sensible a pequeñas cantidades de ADN como SYBR Gold. </li><li> En un tubo de silicona por ejemplo, preparar a 1 ug de ADN en un volumen total de 50 ml con el resto del volumen se esterilizan con dH 2 O. </li></ol> ADN sonicación Sonicación de ADN y el protocolo MeDIP debe realizarse en tubos de siliconzied para impedir la unión no específica de las proteínas de las paredes del tubo. Tiempos óptimos sonicación de las muestras de ADN se basan en el grado de fragmentación del ADN de la muestra determinado a partir de electroforesis en gel (paso 27). Por ejemplo, el ADN extraído de células de cultivo debe ser de muy alto peso molecular, y, posteriormente, se requieren más tratamiento con ultrasonidos que el ADN extraído de muestras de archivo que a menudo son parcialmente degradadas. Si las muestras son de peso molecular alto y uniforme, es razonable en este momento para continuar con el tratamiento con ultrasonidos como se describe en este protocolo sin verificar cada muestra individual. Si las muestras están fragmentadas como con muestras de archivo, será necesario adaptar el procedimiento de ultrasonidos probablemente por la disminución de tiempos de sonicación para obtener 300-100bp fragmentos. Si usted espera para procesar las muestras que están parcialmente degradadas, la optimización de los parámetros de ultrasonidos se puede realizar en una muestra representativa de las de interés. Con base en el grado de fragmentación del ADN observada a partir de electroforesis en gel (paso 27), el experimentador puede predeterminar el tiempo de sonicación óptimo para la muestra. Aquí se describe un método para obtener fragmentos de ADN 300-1000 pb por ultrasonidos con un dispositivo automatizado ultrasonidos (Bioruptor de Diagenode, UCD-200 TM) usando ADN de alto peso molecular. <ol><li> De agua en Biorupter debe ser a 4 ° C. </li><li> Sonicar durante 7 minutos de la configuración automática (30 segundos en 30 segundos de máxima potencia). </li><li> Quitar 800 ng (40 l) del producto sonicado y el lugar en el tubo de centrífuga siliconado 1,7 ml de la inmunoprecipitación (IP) de reacción. </li><li> Ponga a un lado restantes 200 ng (10 l) para servir como entrada (IN) de referencia de ADN (se almacenan a 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON de ADN metilado <ol><li> Desnaturalizar el ADN que será utilizado para la reacción IP (800 ng) a 95 ° C durante 10 minutos en un baño de agua. </li><li> Enfriar inmediatamente en hielo. Deje que se enfríe por completo de ADN (aproximadamente 5 minutos en hielo) antes de proceder con el siguiente paso. </li><li> Añadir 5 mg del anticuerpo monoclonal. </li><li> Añadir tampón IP (usado a temperatura ambiente a lo largo de este protocolo) a un volumen final de 500 microlitros. </li><li> Incubar durante 2 horas a 4 ° C en la rotación de soporte del tubo. </li><li> Justo antes del paso 5 se completa, preparar Dynabeads por el lavado (Pasos 6-11). En primer lugar, suspender las cuentas de fondo en el vial con el vortex. </li><li> Transferencia de 30 l (~ 2 x 10 7) de Dynabeads resuspendido por reacción, más 1, en ​​un nuevo tubo siliconado (por ejemplo, si hace ocho reacciones, eliminar las perlas suficiente para 9, es decir, 270 l). </li><li> Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Pipeta el sobrenadante. Al eliminar el sobrenadante, evite tocar las bolas contra la pared interior (donde las cuentas de atraer al imán) con la punta de la pipeta. </li><li> Retire el tubo del imán, y volver a suspender las bolas en un exceso de volumen de buffer de propiedad intelectual (750 l-1000 l). Coloque el tubo de vuelta en la rejilla magnética durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Repetir el lavado una vez más, y luego volver a suspender las cuentas de lavado en buffer de propiedad intelectual en el volumen original retiró en el paso 7. </li><li> Añadir 30 l de Dynabeads lavado para cada reacción de IP </li><li> Incubar en un soporte de tubo giratorio durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Después de incubación, se coloca el tubo en la rejilla magnética durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Pipeta el sobrenadante. Evite tocar la pared interior del tubo (donde las cuentas de atraer al imán) con la punta de la pipeta. Añadir 500 l de buffer de propiedad intelectual. Mezcle el contenido del tubo y vuelva a colocarlo en el estante magnético durante 2 minutos. Repetir el lavado con 500 ul buffer de propiedad intelectual de una vez. </li><li> Después de retirar el sobrenadante del último lavado, suspender las cuentas en 400 l de tampón de digestión. </li><li> El tratamiento de la reacción con 100 mg de proteinasa K y se incuba durante la noche a 50 ° C. </li></ol> Purificación de ADN immunoprecipitated <ol><li> Añadir 500 l 1:01 pH fenol / cloroformo y agitar bien 7. </li><li> Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo. </li><li> Repita los pasos 1 a 3 si la interfase entre las capas acuosa y orgánica aparece nublado. </li><li> Añada 1 / 10 del volumen 3 ª M de acetato de sodio (40 ml) y agitar. </li><li> Añadir 1 l de glucógeno (20 mg / l) y agitar. </li><li> Añadir dos volúmenes (1000 l) de etanol al 100%, vórtice, y el lugar de -20 º C durante 20 minutos. </li><li> Giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar el etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual. </li><li> Añadir 500 l de etanol 70% frío para lavar. Agitar brevemente, y giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar 70% de etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual con pipeta. </li><li> Deje secar al aire el precipitado con la tapa abierta durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de etanol residual. </li><li> Resuspender el ADN precipitado en 10 l esterilizados dH 2 0. </li></ol> VALIDACIÓN POR PCR <ol><li> Es posible que la prueba para asegurarse de que su procedimiento MeDIP está trabajando mediante la realización del protocolo MeDIP utilizando el ADN humano normal (hombre o mujer), y, posteriormente, ensayar una región conocida por ser enriquecido por metilación. </li><li> Eliminar 30% del producto MeDIP de tubo de PCR, y otro 30% del producto MeDIP a otro tubo de PCR. </li><li> Puesto de 10 ng de ADN en un tubo de PCR, y de 10 ng de ADN en otro tubo de PCR. Ahora debería tener cuatro por separado las reacciones de PCR de configurar. </li><li> Realizar PCR utilizando primers CTRL H19 y como se indica en la Tabla 1. </li><li> Preparar dos mezclas maestras (una para cada conjunto de cebadores) para las reacciones de PCR con 12,5 l volumen total como se indica en la Tabla 2. </li><li> Thermocycle el PCR con las condiciones establecidas en la Tabla 3. </li><li> Carrera de 5 l de los productos de PCR en un gel de agarosa al 2% para la visualización. </li><li> Los resultados esperados para MeDIP éxito se muestran en la Tabla 4. </li></ol> Tablas Tabla 1: H19 y CTRL cebadores para la validación del PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer Set </td><td> Primer avance </td><td> Primer inversa </td><td> El tamaño del producto esperado </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 pb </td></tr><tr><td> CTRL (control) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 pb </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Las mezclas de las reacciones de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (por Rxn) </td><td> CTRL Mix (por Rxn) </td></tr><tr><td&gt; ddH2O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> Buffer 10X </td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> Mezcla de dNTP (10 mM cada uno) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Cebadores (H19_F / R o CTRL_F / R) (10 mM cada F / R) </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. PCR thermocyling condiciones. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> Doce y media </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> Doce y media </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> Doce y quince </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Espera resultados de la PCR para MeDIP éxito. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Plantilla de ADN </td></tr><tr><td> Primer utilizados </td><td> EN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positiva </td><td> Positiva </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positiva </td><td> Negativo </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
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<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Hay una creciente conciencia de los juegos de rol significativo en la enfermedad de la metilación del ADN, por lo tanto el desarrollo de ensayos para medir esta modificación se están convirtiendo cada vez más importante 3, 12, 13. La técnica MeDIP es una herramienta susceptible de cribado, tanto en el de todo el genoma y el lugar específico de nivel 6, 7. Esta técnica proporciona una vista rápida de los niveles de metilación del ADN usando una cantidad limitada de partida de ADN y permite realizar ...

<table><tbody><tr><td>Sonicador Biorupter</td><td>Herramienta</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugos SafeSeal de 1,7 ml</td><td>Otro</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro ND 3300</td><td>Herramienta</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: Anti-5&amp;rsquo;-metilcitosina ratón mAb</td><td>Reactivo</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario: Dynabeads M-280 Oveja anti-ratón IgG</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético para tubos</td><td>Herramienta</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Herramienta</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>Tampón IP</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05 % Triton X-100. Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tampón de digestión</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5 % SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

inmunoprecipitación de adn metilado

Methylated DNA Immunoprecipitation

La identificación de los patrones de metilación del ADN es un procedimiento común en el estudio de la epigenética, como la metilación se sabe que tiene efectos significativos en la expresión génica, y está involucrado con el desarrollo normal, así como la enfermedad<sup&gt; 4.1</sup&gt;. Por lo tanto, la capacidad de discriminar entre el ADN metilado y no metilado de ADN es esencial para la generación de perfiles de metilación de estos estudios. Inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) es una técnica eficiente para la extracción de ADN metilado de una muestra de interés<sup&gt; 5.7</sup&gt;. Una muestra de tan poco como 200 ng de ADN es suficiente para que el anticuerpo, o inmunoprecipitación (IP), la reacción. ADN se somete a sonicación en fragmentos que van desde 300-1000 pb, y se divide en immunoprecipitated (IP) y entrada (IN) porciones. ADN IP posteriormente el calor desnaturalizado y luego incubadas con anticuerpos anti-5&#39;mC, permitiendo que el anticuerpo monoclonal de unirse al ADN metilado. Después de esto, partículas magnéticas que contienen un anticuerpo secundario con afinidad por el anticuerpo primario se agregan y se incuban. Estos anticuerpos de cuentas vinculadas se une al anticuerpo monoclonal que se usa en el primer paso. ADN unido al complejo anticuerpo (ADN metilado) se separa del resto del ADN mediante el uso de un imán para tirar de los complejos de la solución. Varios lavados con buffer de propiedad intelectual se ejecutan después de quitar la consolidados, no ADN metilado. El ADN metilado / anticuerpo se digiere con proteinasa K para digerir los anticuerpos dejando sólo el ADN metilado intacto. El ADN se purifica enriquecido con fenol: cloroformo extracción para eliminar el material de proteína y luego se precipitó y se resuspendió en agua para su uso posterior. Técnicas de PCR se puede utilizar para validar la eficacia del procedimiento MeDIP mediante el análisis de los productos de amplificación de IP y en el ADN de las regiones conocidas de la falta y se sabe que contiene secuencias de metilación. El ADN purificado metilado se puede utilizar para el locus-específica (PCR) o todo el genoma (microarrays y la secuenciación) estudios de metilación, y es particularmente útil cuando se aplica en conjunción con las herramientas de investigación tales como perfiles de expresión genética y la hibridación amplia comparativo del genoma ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. La investigación adicional en la metilación del ADN se llevará al descubrimiento de nuevas dianas epigenéticos, que a su vez, puede ser útil en el desarrollo de nuevas herramientas de investigación terapéutica o pronóstico de enfermedades como el cáncer que se caracterizan por ADN aberrantemente metilados<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Este video muestra el protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). MeDIP es un procedimiento de dos días que selectivamente extrae fragmentos de ADN metilado de una muestra de ADN genómico utilizando anticuerpos con especificidad para el 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Inmunoprecipitación de ADN metilado

La identificación de los patrones de metilación del ADN es un procedimiento común en el estudio de la epigenética, ya que se sabe que la metilación tiene efectos significativos sobre...

Este video demuestra un protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado o meetup. Un método utilizado para aislar específicamente ADN metilado de manera imparcial. La metilación del ADN en mamíferos se caracteriza por la adición de un grupo metilo a la posición C cinco de la citosina.Cuando está presente en un dinucleótido CPG, constituye una marca epigenética reversible que desempeña un papel importante en el desarrollo normal, así como en varios procesos de enfermedades. Las funciones normales de la metilación del ADN incluyen la inactivación del cromosoma X en hembras, el silenciamiento de elementos repetitivos, la impronta genómica y el mantenimiento de la estabilidad genómica. También se ha demostrado que la metilación del ADN desempeña un papel en numerosas enfermedades, como el cáncer, el síndrome de Prader-Willi, el síndrome de ICF (inmunodeficiencia, inestabilidad centromérica y anomalías faciales) y el síndrome de Rett.En los cánceres, por ejemplo, la hipermetilación anormal y los promotores pueden provocar la silenciamiento de genes vitales supresores de tumores. Mientras que la hipometilación inadecuada provoca inestabilidad cromosómica y activación de oncogenes, el encuentro se logra primero mediante la sonicación del ADN en fragmentos cuyo tamaño oscila entre 300 y 1000 pares de bases. Luego, el ADN sonicado se desnaturaliza a 95 grados Celsius.Se añaden anticuerpos primarios, que reconocen la pentametacina, y se permite su unión a fragmentos de ADN metilado. Se utilizan anticuerpos secundarios conjugados a bolas magnéticas Dyna para aislar fragmentos de ADN que han sido unidos por el anticuerpo primario. Los fragmentos no metilados se eliminan y los anticuerpos se digieren mediante proteinasa.La limpieza con fenil cloroformo de KA elimina la proteína digerida y la precipitación purifica el ADN, que ahora está enriquecido en fragmentos metilados. El ADN purificado puede utilizarse en aplicaciones como PCR, microarreglos y secuenciación. El procedimiento generalmente se realiza en dos días.El día uno comprende la preparación del ADN, la sonicación, la inmunoprecipitación y la digestión proteica. El día dos incluye la extracción con fenol-cloroformo y la precipitación con etanol para purificar y aislar el ADN enriquecido en metilación. Se requieren algunos materiales especiales para el procedimiento, incluyendo tubos centrífugos silanizados, un dispositivo de sonicación de ADN, un anticuerpo primario, anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina de ratón, un anticuerpo secundario, perlas DynaBeads conjugadas con anticuerpo secundario de oveja anti-IgG de ratón y un soporte magnético para tubos.El primer paso en el protocolo Meetup es la preparación del ADN. Es fundamental evaluar la naturaleza del ADN previamente. Conocer el estado del ADN de la muestra, si es principalmente bicatenario o monocatenario, es necesario, ya que la cuantificación precisa de la muestra es de suma importancia y diversos métodos para determinar la cantidad de ADN pueden verse afectados negativamente por la presencia de especies de ADN no deseadas.La cantidad de ADN bicatenario se puede evaluar fácilmente mediante fotometría espectral utilizando un NanoDrop 3, 300 nd cargue 1.5 microlitros y configure el tipo de medición en ácido nucleico, seleccione ADN 50 como cálculo e inicialice el instrumento con 1.5 microlitros de agua. Limpie los pedestales y enrasé el instrumento con 1.5 microlitros del líquido. La muestra se disuelve en limpie los pedestales, cargue 1.5 microlitros de la muestra y pulse medir.Se proporcionará la concentración y se puede utilizar. Para calcular el número de microlitros necesario para mí, sumerja un A dos 60 a dos 80 con una relación de 1,8, lo cual es ideal aquí. Se prepara una muestra de un microgramo.Sin embargo, una muestra de tan solo 200 nanogramos es suficiente para obtener resultados exitosos. Para la reunión, cargue la muestra de ADN en un tubo limpio silanizado. Añada agua estéril suficiente para llevar el volumen final a 50 microlitros.La sonicación del ADN y la inmunoprecipitación deben realizarse en tubos silanizados para evitar la unión no específica de ADN y proteínas a las paredes de los tubos. Una vez que el ADN ha sido preparado, la muestra debe ser sonicada; la sonicación es necesaria para fragmentar el ADN, ya que la inmunoprecipitación es más eficiente con fragmentos más pequeños de ADN. Cargue la muestra en el sonicador, asegúrese de que la configuración de potencia esté en alto y de que la máquina esté programada para 30 segundos. Tras 30 segundos de pausa, llene la base hasta la línea de llenado con agua a cuatro grados Celsius.Sonicar la muestra durante siete minutos. Cuando finalice la sonicación, retire el tubo y colóquelo en hielo. Es importante optimizar las condiciones de sonicación para su muestra prevista y el tamaño del ADN de antemano.Por ejemplo, una muestra de ADN parcialmente degradada requerirá un tiempo de sonicación más corto. Los productos de la sonicación pueden visualizarse mediante técnicas electroforéticas estándar. En este momento, se desean fragmentos de ADN cuyo tamaño oscile entre 300 y 1000 pares de bases para su uso posterior.En los ensayos de microarreglo y PCR, debe reservar una quinta parte del ADN como ADN de entrada o de referencia; en este caso, se utilizarán 800 nanogramos de ADN sonicado para la inmunoprecipitación y el resto se guardará como ADN de referencia. El siguiente paso en el protocolo es la reacción de inmunoprecipitación o IP; antes de añadir el anticuerpo primario, el ADN debe desnaturalizarse. La desnaturalización es necesaria porque el anticuerpo primario es sensible al ADN de cadena sencilla.Coloque la muestra en un baño de agua a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Cuando el paso de desnaturalización esté completo, transfiera inmediatamente el tubo a hielo durante al menos cinco minutos. Esto evitará que el ADN desnaturalizado se repliegue y permitirá una unión óptima de los anticuerpos cuando la muestra se haya enfriado.Centrifugar brevemente el tubo para reunir el contenido en el fondo. A continuación, se debe agregar el anticuerpo primario. La cantidad de anticuerpo utilizada debe titrarse para cada lote y para cada fabricante.En este caso, agregamos cinco microgramos de anticuerpo primario y luego añadimos tampón de inmunoprecipitación o tampón IP hasta un volumen final de 500 microlitros. A continuación, el ADN de IP se coloca en un rotador y se deja incubar a cuatro grados Celsius durante dos horas. La rotación es necesaria para evitar la conglomeración del anticuerpo dentro del tubo durante la incubación.Aproximadamente 15 minutos antes de que finalice la incubación con el anticuerpo primario, limpie y prepare las perlas magnéticas Dyna. Primero, suspenda completamente las perlas en el vial mediante vortex. Luego, transfiera 30 microlitros de perlas a un tubo limpio silanizado y coloque ese tubo en un soporte magnético para múltiples reacciones.Transfiera 30 microlitros de perlas por reacción, más la cantidad suficiente para una reacción adicional para permitir errores de pipeteo o pérdida inadvertida de algunas perlas. Por ejemplo, para ocho reacciones, retire la cantidad suficiente de perlas para nueve reacciones o 270 microlitros.Las perlas magnéticas se desplazarán hacia la pared del soporte magnético. Espere dos minutos para que las perlas migren y se asienten formando una franja definida en la pared del tubo. A continuación, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta, asegurándose de no perturbar las perlas en la pared posterior con la punta de la pipeta.Sustituya el sobrenadante por un volumen excesivo de tampón de IP, vortexee y colóquelo de nuevo en el soporte magnético durante dos minutos. Repita este lavado una vez más y resuspenda las perlas de lavado en su volumen original de tampón de IP. Retire el tubo de muestra del rotador cuando finalice la incubación.Para completar la inmunoprecipitación, agregue 30 microlitros de perlas limpias a la reacción y coloque el tubo nuevamente en un rotador durante dos horas a cuatro grados Celsius. Durante esta incubación, el anticuerpo secundario, que es anti ratón IgG, se unirá al anticuerpo primario de ratón. Los anticuerpos anti ratón están conjugados a perlas magnéticas Dyna, lo que permite una fácil recuperación de los productos unidos y el siguiente paso de purificación.Una vez finalizada la incubación con ambos anticuerpos, coloque el tubo de inmunoprecipitación en el soporte magnético durante dos minutos. En este momento, el ADN metilado estará unido al anticuerpo primario, el cual a su vez estará unido al anticuerpo secundario conjugado con perlas Dyna. Retire y deseche el sobrenadante y reemplácelo con 500 microlitros de tampón de inmunoprecipitación.Mezcle el contenido del tubo y colóquelo de nuevo en el soporte durante dos minutos. Repita este lavado con el tampón IP una vez más. Después de eliminar el sobrenadante del último lavado Resus, suspenda las perlas por última vez.En 400 microlitros de tampón de digestión, trate la reacción con 100 microgramos de proteinasa K e incube durante la noche a 50 grados Celsius. El tratamiento con proteinasa K es necesario para digerir las proteínas de los anticuerpos y cualquier proteína residual asociada con el ADN, permitiendo que el ADN metilado se libere en solución. La purificación de ADN se lleva a cabo el segundo día del procedimiento de reunión; retire el tubo de digestión del incubador.En una campana extractora, agregue 500 microlitros de fenol-cloroformo uno a uno a pH siete al tubo y mezcle completamente mediante vortex. Centrifugue el tubo durante 10 minutos a 13.000 ×g. Retire cuidadosamente la fase acuosa superior del tubo sin perturbar la interfase ni eliminar ninguna parte de la capa orgánica. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo.Puede realizarse una segunda extracción si la interfase aparece turbia. A continuación, agregue un volumen igual a un décimo del volumen inicial de acetato de sodio tres molar; en este caso, 40 microlitros. Se puede usar un microlitro de glicógeno como agente transportador para facilitar la limpieza del precipitado.Vortexee el tubo para mezclar el contenido. A continuación, agregue dos volúmenes de etanol al 100 %, vortexee y congele en un congelador a menos 20 grados Celsius durante 20 minutos después de congelar. El ADN precipitado se centrifuga en una centrífuga a 13.000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.Se formará un pellet de ADN en el fondo del tubo. Retire el tubo del centrífugo y elimine el etanol. Tenga cuidado de no perturbar el pellet en el fondo del tubo.Puede ser necesario un centrifugado breve para eliminar cualquier etanol residual. Para lavar el precipitado, añada 500 microlitros de etanol frío al 70 %, vortexee y centrifugue nuevamente durante 20 minutos a 13 000 ×g y 4 °C. Cuando finalice la segunda centrifugación, elimine el etanol al 70 % con un centrifugado breve y retire el etanol residual con una pipeta.Deje el tubo en un portaobjetos con la tapa abierta para secar el precipitado y permitir que el etanol restante se evapore. Finalmente, reuspenda el precipitado que contiene solo ADN enriquecido para metilación en 10 microlitros de agua estéril, permitiendo tiempo suficiente para que el precipitado de ADN se disuelva antes de su uso. Es una buena práctica validar la eficiencia del aislamiento mediante PCR.Esto puede realizarse mediante reacciones de PCR diseñadas para amplificar productos que ilustren diferencialmente fragmentos de ADN metilados y no metilados utilizando cebadores para ADN humano normal. La región de control de impresión H19 puede utilizarse junto con cebadores diseñados para amplificar una región del genoma que no está metilada. En el protocolo adjunto se pueden encontrar ejemplos de secuencias de cebadores y condiciones de ciclado de PCR.En este momento, es necesario recuperar el ADN de entrada o de referencia que se reservó al comienzo del protocolo de reunión. Se preparará un conjunto de reacciones de PCR utilizando el ADN de entrada, y otro conjunto utilizando el ADN de IP enriquecido en metilación. Si la reunión fue exitosa, la PCR de IP producirá un producto utilizando los cebadores de metilación y ningún producto utilizando los cebadores de control.Por el contrario, la PCR de entrada debería producir productos utilizando ambos cebadores, ya que contiene fragmentos de ADN metilados y no metilados. El ADN enriquecido en fragmentos metilados puede utilizarse en diversas aplicaciones posteriores, como la secuenciación por PCR y el análisis mediante microarreglos.Cuando se combina con otras técnicas de biología molecular, puede utilizarse para investigar el estado de metilación del ADN de manera específica por locus o a nivel del genoma completo, con el fin de realizar perfiles de metilación o estudiar la epigenómica.

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