Inmunoprecipitación de ADN metilado

Este video muestra un protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado o meetup. Método utilizado para aislar específicamente el ADN metilado de forma imparcial. La metilación del ADN en mamíferos se caracteriza por la adición de un grupo metilo a la posición C cinco de la citosina.

Cuando está presente en el dinucleótido A CPG, es una marca epigenética reversible que desempeña un papel importante en el desarrollo normal, así como en varios procesos patológicos. Las funciones normales de la metilación del ADN incluyen la inactivación del cromosoma X en las mujeres, el silenciamiento de elementos repetitivos, la impronta genómica y el mantenimiento de la estabilidad genómica. También se ha demostrado que la metilación del ADN desempeña un papel en numerosas enfermedades como el cáncer, el síndrome de Willi, el síndrome de Engelman y la inmunodeficiencia, la inestabilidad centrimérica y el síndrome de anomalía facial.

En los cánceres, por ejemplo, la hipermetilación y los promotores anormales pueden resultar en el silenciamiento de genes supresores de tumores vitales. Si bien la hipometilación incorrecta da como resultado inestabilidad cromosómica y activación de oncogenes, el encuentro se logra mediante el patinaje sónico primero del ADN en fragmentos que varían en tamaño de 300 a 1000 pares de bases. A continuación, el ADN sonicado se desnaturaliza a 95 grados centígrados.

Se añaden anticuerpos primarios, que reconocen cinco metazina principal, y se les permite unirse a fragmentos de ADN metilados. Los anticuerpos secundarios, conjugados con perlas de dina magnéticas, se utilizan para aislar fragmentos de ADN, que han sido unidos por el anticuerpo primario. Los fragmentos no metilados se eliminan y los anticuerpos son digeridos por la proteinasa.

La limpieza con fenilcloroformo KA elimina la proteína digerida y la precipitación purifica el ADN, que ahora está enriquecido para fragmentos metilados. Meetup, el ADN se puede utilizar para aplicaciones como la micromatriz de PCR y la secuenciación. Meetup generalmente se realiza como un procedimiento de dos días.

El primer día implica la preparación del ADN, la sonicación, la inmunoprecipitación y la digestión de proteínas. El segundo día implica la extracción de cloroformo con pH y la precipitación de etanol para purificar y aislar el ADN enriquecido para la metilación. Hay algunos materiales especiales que se requieren para la reunión, incluidos tubos de centrífuga siliconados, un dispositivo de sunación de ADN, anticuerpo primario, ratón con metazina anti cinco primos, anticuerpo monoclonal, anticuerpo secundario, perlas de dina, conjugadas con ovejas, IgG anti-US y un estante de tubos magnéticos.

El primer paso en el protocolo de meetup es la preparación del ADN. Es imperativo evaluar la naturaleza del ADN de antemano. Es necesario conocer el estado del ADN de la muestra, ya sea principalmente bicatenario o monocatenario, ya que la cuantificación precisa de la muestra es de suma importancia y varios métodos para determinar la cantidad de ADN pueden verse afectados negativamente por la presencia de especies de ADN no deseadas.

La cantidad de ADN bicatenario se puede evaluar fácilmente mediante fotometría espectral utilizando un NanoDrop 3, carga de 300 nd 1,5 microlitros y establecer el tipo de medición en ácido nucleico, seleccionar ADN 50 como cálculo e inicializar el instrumento con 1,5 microlitros de agua. Limpie los pedestales y deje en blanco el instrumento con 1,5 microlitros del líquido. La muestra se disuelve en los pedestales, se cargan 1,5 microlitros de la muestra y se golpea la medida.

La concentración se dará y se puede utilizar. Para calcular el número de microlitros necesarios para mí, lo ideal es sumergir una proporción de A dos 60 a dos 80 de 1,8 en este caso. Se prepara una muestra de un microgramo.

Sin embargo, una muestra de tan solo 200 nanogramos es suficiente para obtener resultados exitosos. Para la reunión, cargue la muestra de ADN en un tubo siliconado limpio. Agregue suficiente agua estéril para llevar el volumen final a 50 microlitros.

La sonicación del ADN y la inmunoprecipitación deben realizarse en tubos siliconados para evitar la unión inespecífica del ADN y las proteínas a las paredes de los tubos. Una vez que se ha preparado el ADN, la muestra debe ser sonicada. Se requiere sonicación para fragmentar el ADN, ya que la inmunoprecipitación es más eficiente con fragmentos más pequeños de ADN, cargue la muestra en el sonicato, asegúrese de que la configuración de potencia esté configurada en alta y que la máquina esté configurada en 30 segundos. En 30 segundos de apagado, llene la base en la línea de llenado con cuatro grados centígrados de agua.

Sonicar la muestra durante siete minutos. Cuando termine la sonicación, retire el tubo y colóquelo en hielo. Es importante optimizar las condiciones de sonicación para su muestra anticipada, el tamaño del ADN de antemano.

Por ejemplo, una muestra de ADN parcialmente degradada requerirá un tiempo de sonicación más corto. Los productos de sonicación se pueden visualizar mediante técnicas electroforéticas estándar. En este punto, se desean fragmentos de ADN que varían en tamaño de 300 a 1000 pares de bases de longitud para su uso posterior.

En los ensayos de microarrays y PCR, debe reservar una quinta parte de su ADN para que sirva como ADN de entrada o de referencia, en este caso, se utilizarán 800 nanogramos de ADN sonicado para la inmunoprecipitación y el resto se reservará como ADN de referencia. El siguiente paso en el protocolo de medios es la inmunoprecipitación o reacción IP antes de la adición del anticuerpo primario, el ADN debe ser desnaturalizado. La desnaturalización es necesaria porque el anticuerpo primario es sensible al ADN monocatenario.

Coloque la muestra en un baño de agua a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Cuando se complete el paso de desnaturalización, transfiera inmediatamente el tubo a hielo durante al menos cinco minutos. Esto evitará que el ADN desnaturalizado de Reen se arrodille y permitirá una unión óptima de anticuerpos cuando la muestra se haya enfriado.

Gira el tubo brevemente para llevar el contenido al fondo. A continuación, se debe agregar el anticuerpo primario. La cantidad de anticuerpo utilizada debe ser valorada para cada lote y para cada fabricante.

En este caso, añadimos cinco microgramos de anticuerpo primario y luego añadimos tampón de inmunoprecipitación o tampón IP hasta un volumen final de 500 microlitros. A continuación, el ADN IP se coloca en un rotador y se deja incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas. La rotación es necesaria para evitar la conglomeración de anticuerpos dentro del tubo durante la incubación.

Aproximadamente 15 minutos antes de que se complete la incubación del anticuerpo primario, limpie y prepare las perlas de dina magnéticas. Primero, vuelva a suspender completamente las perlas en el vial mediante vórtice. Luego, transfiera 30 microlitros de perlas a un tubo siliconado limpio y coloque ese tubo en una rejilla magnética para múltiples reacciones.

Transfiera 30 microlitros de perlas por reacción, más lo suficiente para una reacción adicional que permita el error de pipeteo o la pérdida inadvertida de algunas perlas. Por ejemplo, para ocho reacciones. Retire suficientes perlas para nueve reacciones o 270 microlitros.

Las cuentas magnéticas se atraerán hacia la pared del bastidor magnético. Espere dos minutos para que las cuentas migren y se asienten en una raya definida en la pared del tubo. A continuación, retire y deseche la pipeta sobrenadante con cuidado, asegurándose de evitar perturbar las perlas de la pared posterior con la punta de la pipeta.

Reemplace el sobrenadante con un volumen excesivo de vórtice de búfer IP y vuelva a colocarlo en el estante magnético durante dos minutos. Repita este lavado una vez más y vuelva a suspender las perlas de lavado en su volumen original de tampón IP. Recupere el tubo de muestra del rotor cuando finalice la incubación.

Para completar la inmunoprecipitación, agregue 30 microlitros de perlas limpias a la reacción y vuelva a colocar el tubo en un rotador durante dos horas a cuatro grados centígrados. Durante esta incubación, el anticuerpo secundario, que es IgG anti ratón, se unirá al anticuerpo primario del ratón. Los anticuerpos anti ratón se conjugan con perlas de dina magnéticas, lo que permite una fácil recuperación de los productos unidos y el paso de purificación a seguir.

Una vez completada la incubación con ambos anticuerpos, coloque el tubo IP en la gradilla magnética durante dos minutos. En este punto, el ADN metilado se unirá al anticuerpo primario, que a su vez se unirá al anticuerpo secundario conjugado con perlas de dina. Retire y deseche el sobrenadante y reemplácelo con 500 microlitros de tampón IP.

Mezcle el contenido del tubo y vuelva a colocarlo en la rejilla durante dos minutos. Repita este lavado con tampón IP una vez más. Después de retirar el sobrenadante del último lavado Resus, suspenda las cuentas por última vez.

En 400 microlitros de tampón de digestión, tratar la reacción con 100 microgramos de proteinasa K e incubar durante la noche a 50 grados centígrados. El tratamiento con proteinasa K es necesario para digerir las proteínas del anticuerpo y cualquier proteína residual asociada con el ADN, lo que permite que el ADN metilado se libere en la solución. La purificación del ADN se lleva a cabo el segundo día del procedimiento de encuentro, recupere el tubo de digestión de la incubadora.

En una campana extractora, agregue 500 microlitros de cloroformo fenotipo uno a uno a pH siete al tubo y gire el tubo durante 10 minutos a 13, 000. G.Retire con cuidado la fase acuosa superior del tubo sin alterar la interfaz ni eliminar nada de la capa orgánica. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo.

Se puede realizar una segunda extracción si la interfaz parece nublada. A continuación, añade un décimo volumen de acetato de sodio de tres molares en este caso, 40 microlitros. Se puede utilizar un microlitro de glucógeno como portador para facilitar la limpieza de los pellets.

Agite el tubo para mezclar el contenido. Luego agregue dos volúmenes de etanol al 100%, vórtice y congele en un congelador a menos 20 grados centígrados durante 20 minutos después de la congelación. El ADN precipitado se centrifuga a 13.000 g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

Se formará una bolita de ADN en la parte inferior del tubo. Recupere el tubo de la centrífuga y retire el etanol. Tenga cuidado de no tocar el pellet en la parte inferior del tubo.

Puede ser necesario un centrifugado de pulso para eliminar cualquier etanol residual. Para lavar el pellet, agregue 500 microlitros de vórtice de etanol frío al 70% y vuelva a centrifugar durante 20 minutos a 13.000 g y cuatro grados centígrados. Cuando se complete el segundo centrifugado, retire el centrifugado de pulso de etanol al 70% y elimine el etanol residual con una pipeta A.

Deje el tubo en una rejilla con la tapa abierta para secar el pellet y permitir que se evapore el etanol restante. Por último, Reus suspende el pellet que contiene solo ADN enriquecido para la metilación y 10 microlitros de agua estéril, dejando tiempo suficiente para que el pellet de ADN se disuelva antes de su uso. Es una buena práctica validar la competencia de la reunión por PCR.

Esto se puede hacer mediante la ejecución de reacciones de PCR diseñadas para amplificar productos que ilustran fragmentos de ADN metilados y no metilados de manera diferencial para la amplificación de cebadores de ADN humano normal. La región de control de impronta H 19 se puede utilizar junto con cebadores diseñados para amplificar una región del genoma que no está metilada. Por ejemplo, las secuencias de cebadores y las condiciones de ciclo de PCR se pueden encontrar en el protocolo adjunto.

En este punto, es necesario recuperar el ADN de entrada o de referencia que se reservó al comienzo del protocolo de encuentro. Un conjunto de reacciones de PCR se configurará utilizando el ADN de entrada, y el otro conjunto utilizará el ADN IP enriquecido para la metilación. Si la reunión fue exitosa, la PCR IP producirá un producto usando los cebadores de metilación y ningún producto usando los cebadores de control.

Por el contrario, la PCR de entrada debe producir productos utilizando ambos cebadores, ya que contiene tanto metilados como no metilados. Fragmentos de ADN. El ADN enriquecido para fragmentos metilados se puede utilizar para una serie de aplicaciones posteriores, como la secuenciación por PCR y el análisis de microarrays.

Cuando se integra con otras técnicas de biología molecular, se puede utilizar para investigar el estado de metilación del ADN de una manera específica del locus o del genoma completo para el perfil de metilación o el estudio de la epigenómica.