Name: Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprenda a etiquetar proteínas de superficie celular con colorantes CyDye DIGE mínimos usando electroforesis bidimensional. Este método permite detectar proteínas de baja abundancia sin fraccionamiento previo.

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Agradecemos al profesor Dontscho Kerjaschki, Mayrhofer Corina y Krieger Sigurd en el Instituto de Patología Clínica de la Universidad de Viena, Austria, por su colaboración.

De cultivo celular <ol><li> Crecer las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), utilizando los procedimientos estándar de cultivo celular en medio Ham F-12 con glutamax que contiene 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen). </li><li> Cambio del medio de cultivo a medio libre de suero. Etiqueta de proteínas de la superficie de la célula fueron en diferentes momentos con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 tintes mínima (ver sección de etiquetado de superficie celular, a continuación). </li><li> Piscina igual número de células a partir de cada punto del tiempo y la etiqueta con CyDye DIGE Fluor Cy2. Use esto como un estándar interno para cada gel 2-D. </li><li> La mayoría de los experimentos pueden realizarse con células CHO-K1, pero los fibroblastos de embrión de ratón (3T3 L1) y la ascitis del ratón linfoblastos linfoma (EL4) también se puede utilizar (datos no mostrados). </li><li> Crecen los dos tipos de células en este último medio DMEM con glutamax II, pero, de lo contrario, utilice las mismas condiciones utilizadas para las células CHO-K1. </li></ol> Células etiquetado superficie <ol><li> Con cuidado, separar las células adherentes no enzimática, a contar y dividir en partes alícuotas de 5.10 x106 células. De las células que crecen en suspensión, omita el paso separando. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular a unos 800 xg durante 5 minutos. Quitar el sobrenadante que contiene el medio. </li><li> Lavar los pellets por resuspendion en solución salina equilibrada 1 ml de hielo frío de Hank (HBSS) pH 8,5. Centrifugaron a 800 xg a 4 ° C durante 2 minutos. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 200 buffer etiquetado helada l (HBSS pH 8,5, 1 M urea). </li><li> Identificar a las células intactas con 600 pmol tintes CyDye DIGE Fluor mínimo durante 20 minutos sobre el hielo en la oscuridad. </li><li> Detener la reacción añadiendo 20 l 10 mM lisina. Incubar durante 10 minutos. </li><li> Lave la superficie marcada con células dos veces por resuspensión en 500 l HBSS pH 7,4, seguido por centrifugación a 800 xg a 4 ° C durante 2 minutos. </li></ol> Lisis celular y fraccionamiento <ol><li> Lisis de la superficie de células marcadas en 150 l buffer de lisis frío (7 M urea, 2 M tiourea, CHAPS 4%, 30 mM Tris, 5 mM de magnesio acetato de pH 8,5). Dejar en hielo durante al menos 1 h con agitación ocasional. </li><li> Centrifugar los lisados ​​a 10 000 xg a 4 ° C durante 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Esta muestra es la muestra no fraccionada que contiene todas las proteínas celulares. </li><li> Al mismo tiempo, lavar los sedimentos celulares, de arriba, luego fraccionar (con un kit de fraccionamiento de la membrana, Pierce) en la membrana y las fracciones citosólica antes del 2-D electroforesis en gel. La fracción de membrana contiene proteínas de la superficie interna y la membrana celular. </li><li> Para la comparación, siguen el estándar Ettan procedimiento DIGE 3, y lisis, la etiqueta y, por último, fraccionar las células. Determinar la concentración de proteínas en las muestras usando el 2 - D Quant Kit (GE Healthcare). </li></ol> La 2-D <ol><li> Rehidratar geles Immobiline DryStrip, pH 3-11NL (24 cm) con bandeja DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm en 450 l solución de rehidratación DeStreak (0,5% IPG Buffer) durante la noche. </li><li> Aplicar el CyDye marcado muestras (correspondiente a la proteína 50 mg en total) para Immobiline geles DryStrip por la carga de la taza anódica en el colector y realizar el isoelectroenfoque (IEF) con Ettan IPGphor II Sistema de IEF de acuerdo a las instrucciones. </li><li> Después de IEF, se equilibran las tiras en dos pasos y el lugar en la parte superior de las grandes (26 x 20 cm) geles de poliacrilamida al 12,5% (SDS-PAGE). Superposición con el 0,5% de agarosa (en el funcionamiento de un tampón que contiene azul de bromofenol). Ejecutar 2-D utilizando Ettan DALTtwelve vertical de Grandes Sistemas de 5 W / gel durante 30 minutos, y luego a los 15 W / gel hasta que el frente tinte llega a la parte inferior del gel. </li></ol> De imágenes y análisis de datos <ol><li> Después de completar 2-D electroforesis, los geles para la exploración Cy2, Cy3 o Cy5 mediante un tifón 9410 Imager modo variable. </li><li> Comparar mapas de puntos a partir de fracciones de membrana, las fracciones citosólica, y las muestras no fraccionada con DeCyder 2-D software de análisis diferencial 4. </li></ol> Después de la tinción <ol><li> Después de la filmación, la tinción de plata de los geles según el procedimiento estándar de 5. </li></ol> La identificación de proteínas <ol><li> Cultivo, la cosecha, lavado y lisis de las cantidades de preparación (aproximadamente 1 mg de proteína total de 10 x106 células CHO) de las células, como se describe más arriba para una muestra no fraccionada. Utilice una muestra de células Cy5 superficie de la etiqueta (ver arriba) como un pico, y aplicar junto con la cantidad de preparación sin etiqueta de proteínas. </li><li> Llevar a cabo la electroforesis en 2-D como se describió anteriormente, pero esta vez, aplly 600 mg de células sin etiqueta lisado junto con 50 mg de la superficie celular marcado pico anódico por la aplicación de taza. Use marcas de referencia para permitir recoger lugar correcto, y el lugar seentre las placas de vidrio antes de emitir gel de acuerdo con las recomendaciones 3. </li><li> Escanear el gel en Cy5 canal para obtener la superficie de la célula Cy5 mapa de puntos, seguido por la tinción de proteínas totales utilizando la proteína total de profundo color púrpura mancha 3. </li><li> Partido junto a los dos mapas de puntos con el DeCyder 2-D de software y crear una lista de selección para todos los puntos correspondientes a la Cy 5 etiquetados proteínas de superficie celular. Elija las proteínas de la superficie celular con el lugar Ettan estación de manipulación, extracto de los tapones de gel, y trypsinate con el digestor Ettan. Identificar mediante MALDI-TOF espectrometría de masas. </li></ol> Tabla 1. Un experimento Ettan DIGE se realizó con muestras de suero de las células agotadas etiquetados de acuerdo con el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado en la figura 1. <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Muestra </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Momento de agotamiento de suero </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Etiquetado por CyDye </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Gel número </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 30 minutos </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 2 horas </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 4 horas </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16 horas </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

Concentración de proteínas Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La cantidad relativa...

<table><tbody><tr><td>Kit CyDye DIGE, 2 nmol</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>Kit 2-D Quant</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>Tampón IPG pH 3-11NL</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Franja seca Immobiline pH 3-11NL, 24 cm</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>Herramienta</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>Kit IPGbox</td><td>Herramienta</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>Solución de rehidratación DeStreak</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de cobertura para franjas secas Immobiline</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Unidad Ettan IPGphor 3 IEF</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Colector Ettan IPGphor</td><td>Componente del instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Ensamblador de geles Ettan DALTtwelve</td><td>Herramienta</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de separación Ettan DALTtwelve y fuente de alimentación/unidad de control</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>Unidad de 230 V: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Imagenador de modo variable Typhoon 9410</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Seleccionador de manchas Ettan</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>Digestor Ettan</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador Ettan</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis diferencial 2-D DeCyder</td><td>Otro</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis ImageQuant</td><td>Otro</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT) PlusOne</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato sódico (SDS)</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 87% PlusOne</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>ReadySol IEF 40% T, 3% C PlusOne</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>TEMED PlusOne</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato amónico PlusOne</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>Glicina PlusOne</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Preparación de muestras 2-D para proteínas de membrana</td><td>Reactivo</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con cydye dige colorantes fluor mínimo

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Las proteínas de superficie son fundamentales para la capacidad de la célula de reaccionar a su entorno y de interactuar con las células vecinas. Se sabe que son inductoras de...

Mi nombre es María y trabajo en Y Healthcare en NOS, Suecia. Las proteínas de la superficie celular suelen estar involucradas en la comunicación entre las células y su entorno, por lo que son de particular interés en la investigación, con el objetivo de obtener mayor conocimiento sobre enfermedades, así como otras variaciones biológicas inducidas por cambios en el entorno celular. En este video, les mostraré un protocolo sencillo de etiquetado de superficie celular mediante la técnica side-eye dodge, que les permitirá enriquecer visualmente estas proteínas de baja abundancia sin necesidad de amplificación física y estudiar las diferencias de estas proteínas de superficie celular mediante esta tecnología.Si encuentra esta tecnología interesante, puede obtener más información en el manual 2D. Además, disponemos de una nota de aplicación sobre este tema en particular, que puede descargar de job. En el protocolo de etiquetado de la superficie celular que se muestra en la parte superior, usted etiqueta las células mientras aún están intactas. Durante el proceso de etiquetado, el colorante solo tendrá acceso a las proteínas de la superficie celular.Después del paso de marcado, las célula

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