Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Mi nombre es Maria y trabajo en Y Healthcare en NOS, Suecia. Las proteínas de la superficie celular a menudo están involucradas en la comunicación entre las células y su entorno y, por lo tanto, son de particular interés en la investigación, con el objetivo de obtener más información sobre las enfermedades, así como otras variaciones biológicas inducidas por cambios en el entorno celular. En este video le mostraré un protocolo simple de etiquetado de la superficie celular para esquivar con ojo lateral y podrá enriquecer visualmente estas proteínas de baja abundancia sin mejora física y estudiar las diferencias de estas proteínas de la superficie celular con la tecnología.

Si te parece interesante esta tecnología, puedes encontrar más información en el manual 2D. Además, tenemos una nota de aplicación sobre este tema en particular que puede descargar desde el trabajo En el protocolo de etiquetado de la superficie de la celda que se ve en la parte superior, etiqueta las celdas mientras aún están intactas. Durante el proceso de etiquetado, el colorante solo tendrá acceso a las proteínas de la superficie celular.

Después del paso de etiquetado, las celdas se analizan para verificar el etiquetado específico de la superficie de la celda. La muestra de la etiqueta se fraccionó en proteínas de membrana y citosólicas. En paralelo se preparó una muestra no fraccionada.

A modo de comparación, este análisis de fraccionamiento no es necesario, sino que se realizó aquí sólo para mostrar que el protocolo de superficie celular es específico para los consejos profesionales de superficie celular. También realizamos el protocolo estándar de etiquetado ETH no dietético que se ve a continuación, las células son mentiras antes del etiquetado, y de esta manera todas las proteínas celulares son accesibles para el etiquetado. Después de la etapa de etiquetado, las muestras se someten a electroforesis 2D.

Las células adherentes se separan mediante un procedimiento no enzimático para evitar la digestión de las proteínas de la superficie celular objetivo. En este protocolo, usamos el policía de goma, pero el uso de medios de disociación de tres células enzimáticas también es una opción para contar y dividir las suspensiones celulares en cuasi de cinco a 10 millones de células por tubo. A continuación, las células se peletizan y se lavan en H-P-S-S-P-H 7.4 para eliminar los restos de cultivo celular.

contaminación de los medios por proteínas séricas y componentes fluorescentes puede interferir con el etiquetado y la detección. Las células que crecen en suspensión se peletizan directamente y se lavan antes de la etapa de etiquetado después del lavado. La paleta de celdas se resuspende en 200 microlitros de tampón de etiquetado helado que contiene HPSS pH 8,5 y una uria molar.

Para obtener condiciones óptimas de etiquetado de las proteínas de la superficie celular, compruebe siempre el pH. Antes del etiquetado, utilizamos un molde de 600 pic para 10 millones de células CHO. La proporción óptima de ojo lateral en relación con el número de células variará según el tipo de célula.

Ya que no conocemos las concentraciones exactas de proteínas en la superficie celular. En el manual de principios y métodos de electroforesis 2D se describe cómo determinar las condiciones óptimas para el marcaje de proteínas con ojo de reojo. Las células se incuban con ojo lateral D suelo, dados mínimos durante 20 minutos en hielo en la oscuridad.

Después de la reacción de etiquetado, el colorante no reactivo se apaga agregando 20 microlitros de lisina de 10 milimolares. Las celdas de la etiqueta ahora se lavan dos veces con un tampón HPSS pH 7.4 en frío para eliminar el exceso de ojo lateral. Por lo tanto, no quedará ningún colorante libre para el marcaje intracelular no deseado o proteínas en el siguiente paso, que es la lisis celular.

Las proteínas en la superficie celular ahora están etiquetadas y las células están lavadas y listas para ser licitadas. El pellet de la etapa de lavado perdida se resuspende en un tampón de lisis en frío de 150 microlitros que contiene siete molares de uria, dos molares de thi uria, 4% chaps 30 milimolares de árboles cinco milimolares acetato de magnesio pH 8.5 y se deja en hielo durante al menos una hora con ocasionales efectos de vórtice. Las muestras ya están listas para la separación en 2D.

El primer paso en la electrólisis es preparar las tiras de IPD para la rehidratación. Prepare la solución de rehidratación distrital agregando tampón IPG correspondiente al intervalo de pH de las tiras utilizadas y agregue la solución en la lente de la bandeja de rehidratación. Retire la película protectora de la tira de IPG y coloque las tiras con cuidado con un gel seco hacia abajo en la bandeja de rehidratación que contiene la solución de rehidratación.

Cierre la tapa de la caja de IPG y rehidrate las tiras durante la noche. En la primera dimensión, el enfoque isoeléctrico, las proteínas se separan según su pi. Esto se realiza utilizando el IPG cuatro tres.

Las tiras rehidratadas se colocan en el colector y el electrodo se monta en la parte superior. Se aplicaron 50 microgramos de cada muestra utilizando tapones de aplicación de muestra. Hemos aplicado directamente muestras no fraccionadas sin fraccionamiento previo o hemos fraccionado las muestras en fracciones de membrana y citosólicas antes de que se aplicaran.

El cable está cerrado para proteger las muestras fluorescentes de la luz. El instrumento se programó de acuerdo con la recomendación y funcionó durante toda la noche. Los geles grandes de lamby al 12% se costaron utilizando gel adulto 12.

Se añadió una solución de desplazamiento Coster para evitar la polimerización de los geles de acry en los tubos. Los geles se dejaron polimerizar durante la noche a temperatura ambiente antes de su uso. Después del enfoque isoeléctrico, las tiras se retiran y se equilibran en SDS que contiene tampón en dos pasos utilizando DTT para reducir los enlaces de sulfuro de di de los residuos de cisteína, seguidos de alquilación con su acetamida para evitar la modificación por acrilamida.

Las tiras de IPG se sumergen en un tampón de funcionamiento y se colocan cuidadosamente encima de los dos geles de excavación grandes. Evite atrapar el aire entre las tiras y el gel sellado agregando una solución agro derretida al 2% con azul de bromo anol en la parte superior. Los geles ahora están listos para la separación de páginas SDS de segunda dimensión En la página SDS de segunda dimensión.

Las proteínas se separarán según el peso molecular y esto se realiza con el sistema tonal six. Llene la cámara de electroforesis con tampón de funcionamiento anódico, inserte los geles y llene el compartimento superior con el programa de tampón de funcionamiento catódico. La alimentación de acuerdo con las recomendaciones y el funcionamiento de la segunda dimensión están protegidos de la luz durante aproximadamente cuatro a cinco horas o hasta que el frente del tinte llega al fondo del gel.

Después de la electroforesis de segunda dimensión, los casetes de gel se colocan utilizando las pinzas del generador de imágenes fluorescentes Typhoon. Se pueden escanear dos geles y tres canales simultáneamente. El resultado de estas dos DL muestra una alta resolución de las proteínas de membrana en la muestra, incluso si existen algunas restricciones conocidas para que las proteínas hidrofóbicas se detecten en A dos DL. Los resultados muestran muchas nuevas manchas de etiqueta en la superficie celular que se muestran aquí en rojo que no se detectan utilizando el protocolo de etiquetado estándar que se muestra aquí en verde.

Estos resultados muestran que el protocolo de marcaje de superficie celular es altamente específico para el marcaje de proteínas de superficie celular. Dado que las proteínas de la superficie celular están marcadas exclusivamente, se visualizan más fácilmente y se evita la atenuación por proteínas citosólicas abundantes. En la parte superior se muestra la imagen fluorescente de los geles con fracción de membrana no fraccionada o fracción citosólica.

A continuación se muestra una imagen del mismo gel después de la mancha con plata. Los resultados no muestran un marcaje fluorescente de las proteínas citosólicas, pero la tinción de plata muestra que hay proteínas en los geles. Los resultados también muestran patrones de mapas puntuales similares de fracciones no fraccionadas y de membrana, lo que demuestra que no hay necesidad de fraccionamiento antes de la electroforesis 2D, lo que hace que este protocolo sea simple y conveniente.

SI dos, SI tres y SCI cinco muestran patrones de etiquetado similares y todos son compatibles con el protocolo de superficie de celdas. Se realizó un experimento de dieta utilizando los tres ojos laterales DI piso mínimo dy para estudiar la expresión diferencial de las proteínas de la superficie celular en las células CHO de la inanición sérica durante diferentes períodos de tiempo. CY Se agruparon dos muestras de superficie celular de todas las muestras del experimento y se utilizaron como patrón interno.

Los cambios diferenciales de varias proteínas de la superficie celular pudieron seguirse durante el período de inanición. Se detectaron más de 18 nuevas proteínas de membrana utilizando el protocolo de superficie celular que no se detectaron con el protocolo estándar para encontrar la identidad de las proteínas en el gel preparador. Fue necesario aumentar la muestra de la superficie celular para facilitar la coincidencia con los puntos del conjunto de datos analíticos.

Allí los resultados. Los resultados muestran una alta resolución de un gran número de proteínas de la superficie celular. Este protocolo es muy específico para las proteínas de la superficie celular y no se observó ningún marcaje de las proteínas intracelulares.

Con este método, se pueden detectar más proteínas de la superficie celular en comparación con un protocolo estándar y, como ya se ha visto, es un protocolo muy sencillo de ejecutar. Simplemente etiquete las proteínas de la superficie celular mientras aún están intactas y las ejecute directamente en electroforesis 2D sin fraccionamiento de membrana. Por lo tanto, este es un muy buen protocolo para estudiar las proteínas de la superficie celular y las diferencias de las que tienen la tecnología D.