What materials do you need to set up a bacterial transformation lab?

Each workstation requires an ice bucket, tube rack, two sterile 1.5 mL tubes, two 1 mL aliquots of SOC media, competent E. coli cells, a plasmid tube, LB agar plates, and LB agar ampicillin plates. You'll also need appropriate pipettes, a water bath set to 42°C, and a temperature-controlled shaker at 37°C for the bacterial transformation using plasmids procedure.

Why do competent E. coli cells need to be kept on ice during bacterial transformation?

Competent cells must remain on ice to maintain their ability to take up plasmid DNA. Cold temperatures preserve cell membrane permeability and prevent premature DNA uptake. Once thawed, the cells are placed in the ice bucket until they're ready for the heat shock step at 42°C.

What is the purpose of SOC media in bacterial transformation?

SOC media provides nutrients that allow transformed bacteria to recover and express antibiotic resistance genes after the heat shock. The two 1 mL aliquots are used to culture the cells at 37°C in the temperature-controlled shaker, enabling them to survive selection on ampicillin plates.

How do LB agar and LB agar ampicillin plates differ in bacterial transformation?

LB agar plates support growth of all bacteria, serving as a control to verify cell viability and transformation efficiency. LB agar ampicillin plates contain antibiotic that kills non-transformed cells, allowing only bacteria that successfully incorporated the plasmid to survive and form colonies on selective media.

What temperature conditions are critical for successful bacterial transformation?

Two temperatures are essential: 42°C for the heat shock step, which facilitates plasmid DNA entry into competent cells, and 37°C for the temperature-controlled shaker during recovery in SOC media. These precise temperatures ensure optimal transformation efficiency, cell survival, and gene expression.

Why is the plasmid tube stored in an ice bucket before transformation?

The plasmid tube is kept in the ice bucket to prevent DNA degradation and maintain its integrity before introduction into competent cells. Cold temperatures preserve plasmid stability and ensure the DNA remains viable for successful uptake during the transformation process.

Transformation bactérienne

Notions Préparation de l'instructeur Protocole étudiant

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Au début du 20e siècle, un bactériologiste britannique nommé Frederick Griffith travaillait avec la bactérie Streptococcus pneumoniae, responsable de la pneumonie. Il a réalisé une expérience simple en utilisant deux souches différentes. Une souche est connue sous le nom de souche S en raison d’une capsule protectrice qui donne aux colonies ou aux touffes qu’elle forme un aspect lisse et la rend également virulente ou nocive. La seconde était la souche R, une version de la bactérie dépourvue de capsule protectrice, donnant aux colonies un aspect rugueux et les rendant non virulentes.

Tout d’abord, Griffith a pris une partie de la bactérie de la souche S et l’a chauffée, produisant une version tuée thermiquement de la souche S. Ensuite, il a rassemblé quelques souris et les a divisées en quatre groupes. Il a injecté au premier groupe la souche S virulente, et au second la souche R non virulente. Il a dosé le troisième groupe avec la souche S tuée par la chaleur, et enfin, il a combiné la souche S tuée par la chaleur et la souche R, et a injecté ce mélange dans le quatrième groupe. Comme prévu, les souris du premier groupe sont mortes et celles du deuxième et du troisième groupe ont survécu. Mais à la surprise de Griffith, les souris du dernier groupe sont également mortes.

Lorsqu’il a publié son étude en 1928, il a appelé ce mystérieux processus de transformation, car il a spéculé sur la présence d’un principe de transformation sous-jacent, qui a permis à la souche auparavant non virulente de devenir mortelle. Plus tard, en 1943, Avert, MacLeod et McCarty ont rapporté que ce principe transformant était probablement de l’acide désoxyribonucléique, ou ADN, dont nous savons maintenant qu’il s’agit du matériel de l’hérédité. Essentiellement, ce qui s'est passé dans l'expérience de Griffith, c'est que lorsque les bactéries ont été combinées, une partie de l'ADN s'est échappée de la souche S tuée par la chaleur et dans les cellules de la souche R, transformant ces bactéries non virulentes et transmettant l'information pour fabriquer la capsule protectrice, transformant la souche R en une souche virulente, maintenant capable de tuer les animaux du quatrième groupe.

Aujourd’hui, les scientifiques ont mis au point un moyen beaucoup plus simple d’étudier la transformation bactérienne, en utilisant la bactérie E. coli et de petites boucles circulaires d’ADN appelées plasmides. Habituellement, le plasmide utilisé dans les expériences de transformation comprend un gène pour une fonction spéciale, comme la résistance aux antibiotiques. E. coli est un excellent sujet de transformation car il peut présenter une propriété appelée compétence, la capacité d’absorber l’ADN de l’environnement. Essentiellement, cela signifie que dans certaines conditions environnementales, comme un choc chimique, électrique ou thermique, la paroi cellulaire d’E. coli peut devenir temporairement perméable et permettre l’absorption de l’ADN de l’environnement. Une fois que le plasmide est à l’intérieur de E. coli, il peut soit rester dans le cytoplasme de sa nouvelle cellule hôte et être répliqué et exprimé au fil des générations avec le génome, soit il peut s’incorporer complètement dans le génome de l’hôte. Si les bactéries perdent le plasmide à un moment donné, la cellule perdra également sa résistance aux antibiotiques, et les scientifiques cultivent donc les bactéries dans un milieu contenant l’antibiotique pour s’assurer que les seuls survivants sont ceux contenant le plasmide d’intérêt.

Dans ce laboratoire, vous apprendrez à transformer des cellules E. coli avec un plasmide contenant un gène de résistance aux antibiotiques, tout en pratiquant des techniques microbiologiques stériles.