Transformation bactérienne

1. Transformation bactérienne Expand
   • IMPORTANT : En plus de porter l’équipement de protection individuelle approprié, assurez-vous de garder votre visage à l’écart des cultures en suspension et d’éviter d’inhaler des réactifs. Ne touchez pas votre visage pendant l’expérience. Lavez-vous toujours les mains avant et après chaque expérience.
   • Lorsque vous êtes prêt à commencer en toute sécurité, assurez-vous d’avoir un ou plusieurs tubes de cellules E. coli compétentes dans votre seau à glace.
   • Ensuite, transférez 50 μL de l’un de ces tubes vers chacun des deux nouveaux tubes de micro-centrifugeuse, l’un étiqueté '-', et l’autre étiqueté '+'.
   • Ensuite, pipetez 2 μL de plasmide p-GREEN dans le tube plus et effleurez doucement le tube pour incorporer le plasmide dans toute la solution bactérienne. L’hypothèse expérimentale est que sur des plaques ne contenant aucun antibiotique, les bactéries avec ou sans plasmide peuvent survivre, et donc les deux feront pousser des pelouses de bactéries. À l’inverse, sur les plaques contenant l’antibiotique ampicilline, seules les bactéries transformées avec succès avec le plasmide de résistance se développeront, tandis que les plaques plasmides négatives ne contiendront aucune bactérie. L’hypothèse nulle de cette expérience est qu’il n’y aura pas de différence de croissance bactérienne entre les plaques.
   • Incuber les deux tubes sur de la glace.
   • Après 30 minutes, immergez les deux tubes aux 3/4 dans l’eau d’un bain-marie à 42 °C pendant 30 secondes.
   • À la fin de l’incubation au bain-marie, remettez les tubes sur de la glace pendant 5 minutes, puis ajoutez 950 μL de milieu SOC à température ambiante dans chaque tube.
   • Incuber les tubes dans un agitateur à 37 °C pendant 60 minutes à 250 tr/min.
   • Pendant que les tubes sont en incubation, étiquetez les fonds d’un LB et d’un LB/ampicilline, ou d’une plaque AMP, « + plasmide », et les fonds d’une plaque LB et d’une plaque LB/AMP « - plasmide ».
   • À la fin de l’incubation, pipeter 50 μL du tube cellulaire « + plasmide » sur la plaque LB/AMP plus et la plaque LB plus.
   • Ensuite, avec une nouvelle pointe, ajoutez 50 μL des bactéries qui n’ont pas été exposées au plasmide à chacune des plaques négatives.
   • Ensuite, étalez chaque plaque à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette.
   • Couvrez les plaques avec leurs couvercles, puis scellez-les avec un film de laboratoire.
   • Rangez ensuite les plaques à l’envers dans un incubateur à 37 °C pendant 24 heures.
2. Résultats Expand<ul class="lab-items">
3. Le lendemain de la transformation, observez quelles plaques contiennent des bactéries et comment les bactéries sont réparties sur chaque plaque.
4. Enregistre le nombre de colonies et la couleur des colonies pour différentes conditions. Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
5. Pour déterminer la masse initiale, IM, du plasmide, multipliez d’abord la concentration plasmidique du tube mère de p-GREEN par le volume transféré dans le tube expérimental.
6. Pour calculer la quantité d’ADN répartie sur chaque plaque, divisez le volume de suspension bactérienne réparti sur chaque plaque par le volume de la suspension dans le tube, et multipliez cette fraction par la masse initiale de plasmide utilisée.
7. Pour déterminer l’efficacité de la transformation, comptez toutes les colonies visiblement distinctes sur la plaque LB/AMP du plasmide plus, et divisez ce nombre par la masse de propagation du plasmide. REMARQUE : L’unité de l’efficacité de la transformation est cfu/μg d’ADN plasmidique.
8. Enregistrez tous les résultats de chaque plaque du tableau et analysez-les.
9. Observez les différences entre les colonies et faites des hypothèses pour expliquer cette observation. Considérez les facteurs qui peuvent affecter l’efficacité de transformation des bactéries compétentes.
10. REMARQUE : Vous aurez également remarqué que chaque plaque avait un résultat différent. Les plaques LB du plasmide négatif et du plasmide positif doivent avoir développé beaucoup de bactéries sur leurs plaques. La plaque de plasmide négatif LB/AMP ne doit pas présenter de croissance bactérienne. Et la plaque plus plasmidique LB/AMP devrait avoir développé des colonies bactériennes qui ont été fluorescentes en vert.

Dans cette expérience, vous transformerez des bactéries avec un plasmide contenant à la fois un antibiotique et un marqueur fluorescent vert. Vous les cultiverez ensuite ainsi qu’un témoin non transformé sur des plaques de tarière avec et sans l’antibiotique sélectif. En plus de porter l’équipement de protection individuelle approprié, assurez-vous de garder votre visage à l’écart des cultures en suspension et d’éviter d’inhaler des réactifs.

Ne touchez pas votre visage pendant l’expérience. Et lavez-vous toujours les mains avant et après chaque expérience. Lorsque vous êtes prêt à commencer en toute sécurité, assurez-vous d’avoir un ou plusieurs tubes de cellules E. coli compétentes dans votre seau à glace.

Transférez ensuite 50 microlitres de l’un de ces tubes dans chacun des deux nouveaux tubes de micro-centrifugeuse, l’un étiqueté moins et l’autre étiqueté plus. Ensuite, placez deux microlitres de plasmide p-GREEN dans le tube plus et effleurez doucement le tube pour incorporer le plasmide dans la solution bactérienne. L’hypothèse expérimentale est que sur des plaques ne contenant aucun antibiotique, les bactéries avec ou sans plasmide peuvent survivre, et donc les deux feront pousser des pelouses de bactéries.

À l’inverse, sur les plaques contenant l’antibiotique ampicilline, seules les bactéries transformées avec succès avec le plasmide de résistance se développeront, tandis que les plaques plasmides négatives ne contiendront aucune bactérie. L’hypothèse nulle de cette expérience est qu’il n’y aura pas de différence de croissance bactérienne entre les plaques. Incuber les deux tubes sur de la glace.

Après 30 minutes, immergez les deux tubes aux 3/4 dans l’eau d’un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. À la fin de l’incubation au bain-marie, replacez les tubes sur de la glace pendant cinq minutes, puis ajoutez 950 microlitres de milieu SOC à température ambiante dans chaque tube ; Avant d’incuber les tubes dans un agitateur à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes à 250 tr/min. Pendant l’incubation des tubes, étiquetez les fonds d’un LB et d’un LB/ampicilline, ou d’une plaque AMP, plus le plasmide, et les fonds d’une plaque LB et d’une plaque LB/AMP moins le plasmide.

À la fin de l’incubation, pipetez 50 microlitres du tube de cellules plasmidiques plus sur la plaque LB/AMP plus et la plaque LB plus. Ensuite, avec une pointe fraîche, ajoutez 50 microlitres de bactéries qui n’ont pas été exposées au plasmide à chacune des plaques négatives. Étalez ensuite chaque plaque à l’aide d’une pointe de pipette fraîche.

Couvrez les plaques avec leurs couvercles, puis scellez-les avec un film de laboratoire. Conservez ensuite les assiettes à l’envers dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain de la transformation, observez quelles plaques contiennent des bactéries et comment les bactéries sont réparties sur chaque plaque.

Notez le nombre de colonies et la couleur des colonies pour différentes conditions, dans ce tableau. Pour déterminer la masse initiale, IM, du plasmide, il faut d’abord multiplier la concentration plasmidique du tube mère de p-GREEN par le volume transféré dans le tube expérimental. Pour calculer la quantité d’ADN répartie sur chaque plaque, il suffit de diviser le volume de suspension bactérienne répandu sur chaque plaque par le volume de la suspension dans le tube, et de multiplier cette fraction par la masse initiale de plasmide utilisée.

Pour déterminer l’efficacité de la transformation, comptez toutes les colonies visiblement distinctes sur la plaque LB/AMP du plasmide plus, et divisez ce nombre par la masse de propagation du plasmide. Par conséquent, l’unité d’efficacité de transformation est l’ufc par microgramme d’ADN plasmidique. Notez tous les résultats de chaque plaque dans le tableau et analysez-les.

Pourquoi pensez-vous que les colonies ont l’air différentes ? Pouvez-vous expliquer les différences de couleur ? Pouvez-vous calculer l’efficacité de transformation de toutes les plaques ?

Quels types de facteurs peuvent affecter l’efficacité de transformation des bactéries compétentes ? Vous aurez également remarqué que chaque assiette avait un résultat différent. Les plaques LB du plasmide négatif et du plasmide positif doivent avoir développé beaucoup de bactéries sur leurs plaques.

La plaque de plasmide négatif LB/AMP ne doit pas présenter de croissance bactérienne. Et la plaque plus plasmidique LB/AMP devrait avoir développé des colonies bactériennes qui ont été fluorescentes en vert.