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Au débutdu 20e siècle, la pneumonie était responsable d’une grande partie des décès dus aux maladies infectieuses1. Afin de mettre au point un vaccin efficace contre la pneumonie, Frederick Griffith a entrepris d’étudier deux souches différentes de Streptococcus pneumoniae : une souche non virulente d’apparence rugueuse (souche R) et une souche virulente d’aspect lisse (souche S) due à une capsule polysaccharidique externe2. Cette couche externe de la bactérie de la souche S leur a permis de résister au système immunitaire de l’hôte, ce qui a finalement conduit à une maladie potentiellement mortelle. Lorsque Griffith a injecté séparément à des souris des bactéries tuées par la chaleur de l’une ou l’autre souche, les souris ont survécu. Cependant, lorsqu’il a injecté à des souris une combinaison de la souche S tuée par la chaleur avec de la souche R vivante, les souris sont mortes2. Lorsqu’il a analysé les échantillons obtenus à partir de souris mortes injectées avec la combinaison, il a observé la présence de bactéries vivantes de la souche S. En 1928, Griffith a noté qu’un processus de « transformation » a dû avoir lieu pour transformer les bactéries non virulentes en souche virulente. En tant que première découverte connue de la transformation bactérienne, sa découverte a ouvert la voie au développement d’un outil essentiel en génie génétique - la transformation3.
La transformation est le changement génétique dans une cellule dû à l’incorporation d’ADN de l’environnement. Dans l’expérience de Griffith, l’ADN qui code pour le revêtement polysaccharidique protecteur des bactéries de la souche S ne s’est pas décomposé sous l’effet du choc thermique et a été introduit dans la souche R, permettant à cette dernière de contourner le système immunitaire de la souris. Alors que ce processus se produit constamment dans la nature entre des organismes et même des espèces différentes, les scientifiques transforment les bactéries en laboratoire à des fins de recherche4.
Les bactéries sont les organismes idéaux pour la transformation, car elles peuvent facilement absorber du matériel génétique exogène dans leur génome et l’amplifierrapidement3,5. Ils ont un chromosome circulaire et plusieurs petits morceaux circulaires d’ADN double brin appelés plasmides dans le cytoplasme. Ces plasmides peuvent se répliquer indépendamment de l’ADN chromosomique et offrent généralement certains avantages fonctionnels, tels que la résistance aux antibiotiques6,7. Dans leur environnement naturel, les bactéries subissent une « transformation bactérienne » en absorbant des plasmides d’autres bactéries dans un processus appelé conjugaison8. De plus, lorsqu’ils se multiplient, chacun de leurs descendants reçoit une copie du nouveau plasmide.
Les plasmides utilisés à des fins expérimentales sont appelés vecteurs plasmidiques. En laboratoire, les scientifiques peuvent créer artificiellement des « plasmides recombinants » d’une longueur d’environ 5 000 à 10 000 paires de bases en insérant des fragments d’ADN dans un vecteur plasmidique. Ces plasmides recombinants ont généralement certains composants : une origine de réplication (ORI), un gène de résistance aux antibiotiques, un site de clonage multiple, un promoteur, un marqueur de sélection et le gène d’intérêt. L’origine de la réplication est là où la réplication commence. Le gène de résistance aux antibiotiques permet aux bactéries qui absorbent le plasmide de survivre sur des plaques en présence d’un certain médicament antibiotique. Bien que les plasmides soient des morceaux d’ADN relativement petits, les scientifiques doivent traiter les cellules hôtes pour permettre la pénétration du plasmide à travers la membrane cellulaire. Par conséquent, l’efficacité de la transformation est directement liée à la porosité de la membrane hôte. Une approche courante consiste à choquer thermiquement les bactéries qui ont été traitées avec une solution de chlorure de calcium9. Les bactéries qui n’incorporent pas le plasmide ne se transformeront pas, et n’ont donc aucune résistance pour survivre sur la plaque et être visibles. Les multiples sites de clonage facilitent l’insertion de l’ADN en contenant des sites pour les enzymes de restriction afin de couper le plasmide où le gène d’intérêt peut être inséré et ligaturé. Le promoteur entraîne la transcription du gène d’intérêt. Il est marqué par un marqueur, généralement une protéine fluorescente telle qu’une protéine fluorescente verte (GFP), ou peut être un gène de résistance aux antibiotiques supplémentaire. Le gène de résistance aux antibiotiques et les autres marqueurs de sélection nous aident à déterminer si les bactéries collectées contiennent le plasmide d’intérêt.
Des méthodes de transformation efficaces ont permis aux scientifiques d’isoler et de profiler les gènes et les produits géniques et ont conduit à de nombreuses avancées dans les sciences de la vie et la médecine, telles que le développement de médicaments efficaces, la génération de cultures génétiquement modifiées et des outils de diagnostic avancés10. De plus, avec les progrès technologiques, de nouvelles méthodes de transformation ont vu le jour. Par exemple, le clonage de passerelle permet l’insertion de plusieurs fragments d’ADN dans différents vecteurs ainsi que le transfert de séquences d’ADN entre les plasmides11. De plus, CRISPR-Cas9 est une technique d’édition de gènes qui modifie directement les nucléotides du génome et ne nécessite pas l’utilisation de plasmides12. Après transformation, les chercheurs isolent et profilent souvent le gène d’intérêt et ses produits. Par la suite, l’ensemble du processus de clonage génétique a ouvert un nouveau champ de manipulation génétique. Grâce au clonage génétique, les chercheurs peuvent manipuler les bactéries pour produire de grandes quantités de protéines humaines spécifiques, telles que l’insuline pour traiter les patients diabétiques10. Le clonage a également joué un rôle majeur dans l’agriculture moderne. Les organismes génétiquement modifiés (OGM) sont le résultat direct du clonage génétique et de la transformation bactérienne10. Par exemple, les scientifiques s’efforcent de générer des cultures génétiquement modifiées avec des gènes fixateurs d’azote incorporés dans leur génome pour stimuler la production alimentaire et réduire l’utilisation d’engrais, diminuant ainsi l’impact économique et environnemental des engrais13. En somme, la transformation bactérienne est la première étape de la biotechnologie moderne et le fondement des futures découvertes de la recherche.
Au début du 20ème siècle, un bactériologiste britannique nommé Frederick Griffith travaillait avec la bactérie Streptococcus pneumoniae. Il a réalisé une expérience simple en utilisant deux souches différentes. Une souche est connue sous le nom de souche S en raison d’une capsule protectrice qui donne aux colonies ou aux touffes qu’elle forme un aspect lisse et la rend également virulente ou nocive. La seconde était la souche R, une version de la bactérie dépourvue de capsule protectrice, donnant aux colonies un aspect rugueux et les rendant non virulentes.
Tout d’abord, Griffith a pris une partie de la bactérie de la souche S et l’a chauffée, produisant une version tuée thermiquement de la souche S. Ensuite, il a rassemblé quelques souris et les a divisées en quatre groupes. Il a injecté au premier groupe la souche S virulente, et au second la souche R non virulente. Il a dosé le troisième groupe avec la souche S tuée par la chaleur, et enfin, il a combiné la souche S tuée par la chaleur et la souche R, et a injecté ce mélange dans le quatrième groupe. Comme prévu, les souris du premier groupe sont mortes et celles du deuxième et du troisième groupe ont survécu. Mais à la surprise de Griffith, les souris du dernier groupe sont également mortes.
Lorsqu’il a publié son étude en 1928, il a appelé ce mystérieux processus de transformation, car il a spéculé sur la présence d’un principe de transformation sous-jacent, qui a permis à la souche auparavant non virulente de devenir mortelle. Plus tard, en 1943, Avert, MacLeod et McCarty ont rapporté que ce principe transformant était probablement de l’acide désoxyribonucléique, ou ADN, dont nous savons maintenant qu’il s’agit du matériel de l’hérédité. Essentiellement, ce qui s'est passé dans l'expérience de Griffith, c'est que lorsque les bactéries ont été combinées, une partie de l'ADN s'est échappée de la souche S tuée par la chaleur et dans les cellules de la souche R, transformant ces bactéries non virulentes et transmettant l'information pour fabriquer la capsule protectrice, transformant la souche R en une souche virulente, maintenant capable de tuer les animaux du quatrième groupe.
Aujourd’hui, les scientifiques ont développé une méthode beaucoup plus simple pour étudier la transformation bactérienne, en utilisant les bactéries E. coli et de petites boucles circulaires d’ADN appelées plasmides. Habituellement, le plasmide utilisé dans les expériences de transformation comprend un gène pour une fonction spéciale, comme la résistance aux antibiotiques. E. coli est un excellent sujet de transformation car il peut présenter une propriété appelée compétence, la capacité de prélever l’ADN de l’environnement. Essentiellement, cela signifie que dans certaines conditions environnementales, comme un produit chimique, un choc électrique ou thermique, la paroi cellulaire de E. coli peut devenir temporairement perméable et permettre l’absorption de l’ADN de l’environnement. Une fois que le plasmide est à l’intérieur de E. coli, il peut soit rester dans le cytoplasme de sa nouvelle cellule hôte et être répliqué et exprimé au fil des générations avec le génome, soit il peut s’incorporer complètement dans le génome de l’hôte. Si les bactéries perdent le plasmide à un moment donné, la cellule perdra également sa résistance aux antibiotiques, et les scientifiques cultivent donc les bactéries dans un milieu contenant l’antibiotique pour s’assurer que les seuls survivants sont ceux contenant le plasmide d’intérêt.
Dans ce laboratoire, vous apprendrez à transformer des cellules E. coli avec un plasmide contenant un gène de résistance aux antibiotiques, tout en pratiquant des techniques microbiologiques stériles.
