Pourquoi le phosphate monosodique est-il un tampon efficace près du pH 7 ?

Le phosphate monosodique est efficace près du pH 7 car sa plage de pKa est de 6,8 à 7,2, qui se chevauche avec le pH cible. Les tampons sont plus efficaces proches de leur pKa, où l'acide faible et la base conjuguée sont présents en concentrations significatives. Cela permet au tampon de résister aux changements de pH lorsque de petites quantités d'acide ou de base sont ajoutées.

Comment les formes protonées et déprotonées du rouge neutre diffèrent-elles en couleur et en absorption de la lumière?

La forme protonée du rouge neutre est rouge et absorbe la lumière verte, tandis que la forme déprotonée est jaune-orange et absorbe la lumière bleu-violet. Ces longueurs d'onde d'absorption distinctes permettent aux chercheurs de suivre l'état d'ionisation du rouge neutre à travers différentes valeurs de pH en utilisant la spectroscopie d'absorption.

Comment la liaison aux protéines affecte-t-elle les propriétés du rouge neutre ?

La liaison aux protéines modifie à la fois l'absorbance et le pKa du rouge neutre. Lorsque la protéine lieuse de la riboflavine se lie au rouge neutre, le pKa augmente d'environ une unité, indiquant que le rouge neutre protoné lié est un acide plus faible que le rouge neutre protoné libre d'un ordre de grandeur.

Quel est le point isosbestique dans un spectre d'absorption?

Le point isosbestique est la longueur d'onde où tous les spectres d'absorption se croisent en un seul point, indépendamment du pH. L'enregistrement de cette longueur d'onde aide à vérifier la qualité des données et indique une transition nette entre les formes protonées et déprotonées du rouge neutre sur toute la plage de pH testée.

Comment déterminez-vous le pKa du rouge neutre à partir des données d'absorbance?

Tracez l'intensité d'absorbance à lambda max en fonction du pH pour le rouge neutre libre et lié. Calculez le point médian entre les valeurs d'absorbance les plus élevées et les plus faibles, puis trouvez le pH auquel ce point médian se produit sur la ligne tracée. Cette valeur de pH est le pKa du composé.

Pourquoi est-il important de manipuler correctement les cuvettes lors de la spectrophotométrie?

Les cuvettes doivent être tenues par leurs côtés texturés et avoir leurs côtés transparents essuyés proprement avant la mesure pour assurer des lectures d'absorbance précises. Les côtés transparents doivent s'aligner avec le faisceau lumineux du spectrophotomètre. Une manipulation correcte prévient les empreintes digitales et la contamination qui interféreraient avec la transmission de la lumière et fausseraient les résultats.

Tampons

Notions clés Préparation de l’enseignant Protocole de l’étudiant

0 vues04:35 min

Les tampons sont des solutions qui visent à maintenir un pH constant dans un système, indépendamment de l’ajout d’acides ou de bases forts. En l’absence de tampons, l’ajout d’un acide fort ou d’une base à une solution modifie considérablement le pH. Les tampons sont cruciaux dans la vie quotidienne. Par exemple, le sang agit comme un tampon et est capable de maintenir un pH entre 7,35 et 7,45, car un pH supérieur à 7,8 ou inférieur à 6,8 peut entraîner la mort.

Alors, comment fonctionne un tampon ? Un tampon est essentiellement un acide ou une base faible et sa base conjuguée ou un acide en équilibre les uns avec les autres. Prenons, par exemple, un tampon à base d’acide acétique et d’acétate de sodium. La solution tampon contient un acide faible et son sel conjugué, qui se dissocie pour former l’acétate de base conjuguée. La solution est acide car le K_a de l’acide acétique est supérieur au K_b de la base conjuguée.

N’oubliez pas que la constante de dissociation, K_a ou K_b, définit la force de l’acide ou de la base, respectivement, car il s’agit de la constante d’équilibre pour la dissociation du composé dans l’eau. La constante de dissociation peut également être représentée par pK_a

Print Procedure Steps

Source : Smaa Koraym de l’Université Johns Hopkins, MD, États-Unis

Préparation 50 mM NaH₂PO₄ Tampon, pH 7

Dans la première partie de cette expérience, vous préparerez une solution de phosphate de sodium tamponnée à pH 7,0. Le phosphate monosodique est un acide faible avec la base conjuguée, le phosphate disodique. Les solutions de phosphate monosodique non ajustées ont généralement un pH d’environ 4 à 6.

Les tampons sont plus efficaces près de leur pKa, qui est de 6,8 à 7,2 pour le phosphate monosodique. Ainsi, vous utiliserez le NaOH pour pousser l’équilibre vers la base conjuguée sans modifier la composition globale de l’équilibre tampon.

Avant de commencer l’expérience, calculez la masse de phosphate monosodique dont vous aurez besoin pour faire 200 mL d’une solution de 50 mM.

Tableau 1 : Préparation d’un tampon 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0

Masse molaire de NaH₂PO₄ = 119,98 g/mol
Volume de la solution (mL)	200
Molarité (mM)	50
Moles de NaH₂PO₄ (mol)
Masse nécessaire (mg)
Volume initial de 1 M de NaOH (mL)
Volume final de 1 M de NaOH (mL)
Volume de NaOH utilisé (mL)
Volume d’eau DI nécessaire (mL)

Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1

Pour commencer, enfilez l’équipement de protection individuelle nécessaire, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité résistantes aux éclaboussures et des gants. note: Cette section du laboratoire utilise du NaOH, qui est corrosif et toxique. Soyez prudent lorsque vous versez et transportez du NaOH.
Remplissez une bouteille de lavage en plastique de 250 ml avec de l’eau déminéralisée.
Étiquetez deux béchers de 100 ml, l’un pour les déchets aqueux neutres et l’autre pour les déchets aqueux basiques.
Étalonnez votre pH-mètre à l’aide des tampons fournis. Rangez la sonde dans sa solution de stockage lorsque vous avez terminé.
Tare le papier de pesée, et utilisez une spatule propre pour mesurer la quantité requise de phosphate monosodique selon vos calculs. Notez la quantité exacte de phosphate monosodique dans votre cahier de laboratoire. note: Le phosphate monosodique absorbe l’humidité de l’air, alors travaillez rapidement pour obtenir une mesure précise et fermez hermétiquement le récipient lorsque vous en avez terminé.
Placez le phosphate monosodique dans un bécher de 400 ml et nettoyez la spatule avec une lingette de laboratoire. Jetez le papier de pesée et la lingette de laboratoire avant de retourner dans votre hotte.
Utilisez un cylindre gradué pour mesurer 175 mL d’eau déminéralisée. Versez l’eau dans le bécher de phosphate monosodique et ajoutez un barreau d’agitation magnétique.
Agitez la solution jusqu’à ce que le sel soit complètement dissous et que la solution apparaisse homogène. Cela prend généralement 2 à 3 min.
Mesurez 15 ml d’eau déminéralisée et versez-le dans le bécher. Continuez à remuer la solution jusqu’à ce qu’elle apparaisse à nouveau homogène (environ 1 à 2 min). Éteignez le moteur d’agitation.
Rincez la sonde de pH avec de l’eau déminéralisée, puis fixez-la dans la solution avec le capteur au-dessus de la barre d’agitation.
Apportez un cylindre gradué de 10 ml et un verre de montre à la hotte de distribution et mesurez 10 ml de 1 M de NaOH. Notez le volume exact dans le cylindre gradué.
Couvrez votre NaOH avec le verre de la montre, et apportez-le soigneusement à votre hotte.
Reprendre l’agitation de la solution de phosphate monosodique. Tout en surveillant la lecture du pH, utilisez une pipette jetable pour ajouter lentement du NaOH à la solution d’agitation par gouttes. Une fois que le pH du tampon atteint 7,0, renvoyez le NaOH encore dans la pipette dans le cylindre gradué.
Calcule le volume de NaOH que vous avez ajouté au tampon. Soustrayez ce volume de 10 ml pour déterminer la quantité d’eau déminéralisée que vous devez ajouter à votre tampon pour atteindre un volume total de solution de 200 ml.
Mesurez l’eau déminéralisée avec un autre cylindre gradué de 10 ml et ajoutez-la à la solution d’agitation pour terminer la fabrication du tampon.
Rincez la sonde de pH avec de l’eau déminéralisée, couvrez-la avec le capuchon rempli de solution de stockage et débranchez ou éteignez la sonde.
Étiquetez une bouteille de polyéthylène de 250 ml comme 'tampon de phosphate monosodique de 50 mM, pH 7.0'. Récupérez la barre d’agitation magnétique de la solution.
Utilisez un entonnoir pour verser la solution tampon dans le flacon étiqueté et le boucher hermétiquement.

Spectroscopie d’absorption du rouge neutre libre et lié
Les tampons peuvent être utilisés pour évaluer les composés à des valeurs de pH spécifiques. Dans cette section, vous allez enregistrer le spectre d’absorbance de l’indicateur rouge neutre dans différents tampons. La forme protonée du rouge neutre est rouge et la forme déprotonée est jaune-orange, ce qui signifie qu’elles absorbent respectivement la lumière verte et bleu-violet. Ainsi, les formes acides et basiques ont des longueurs d’onde d’absorption distinctes. La liaison aux protéines modifie les propriétés du rouge neutre, modifiant à la fois son absorbance et son pKa.

Après avoir mesuré le spectre d’absorbance du rouge neutre libre à plusieurs valeurs de pH, vous ajouterez de la protéine de liaison à la riboflavine, ou RP, aux solutions et mesurerez à nouveau les absorbances. L’intensité de l’absorbance est liée à la concentration, vous utiliserez donc les spectres pour déterminer le pKa du rouge neutre libre et lié après le laboratoire.
- Dessine le tableau suivant dans ton cahier de laboratoire. Numérotez les cuvettes de 1 à 10 et énumérez les neuf valeurs de pH tampon que vous utiliserez. La 10ème cuvette sera une ébauche d’eau désionisée. note: Tenez toujours les cuvettes par les côtés texturés et essuyez les côtés transparents juste avant de mettre la cuvette dans le spectrophotomètre. N’oubliez pas d’aligner les côtés transparents avec le faisceau de lumière dans le spectrophotomètre.
  Tableau 2 : Absorbance du rouge neutre libre et lié
  
  Cuvette # Tampon pH Abs. à λ_max(NRH⁺ libre) Abs. à λ_max (NRH lié)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 vide
  Cliquez ici pour télécharger le Tableau 2
- Obtenez dix cuvettes et bouchons de 1,5 ml et étiquetez-les de 1 à 10 pour qu’ils correspondent à la table de votre cahier de laboratoire.
- Étiquetez un bécher de 25 ml comme 'DIH2O' et remplissez-le d’eau désionisée.
- Jetez vos déchets aqueux neutres dans le drain et renommez le bécher comme 'déchet tampon aqueux'.
- Étiquetez un bécher de 400 ml pour les pointes de micropipette utilisées.
- Fixez une pointe à une micropipette de 1 mL et utilisez-la pour distribuer 1000 μL d’eau déminéralisée dans la cuvette 10. Il s’agit de votre ébauche de solvant.
- Placez 925 μL de votre tampon de phosphate monosodique pH 7.0 dans la cuvette 5.
- Apporte les cuvettes vides restantes à la table de tampon. À l’aide de la table de votre cahier de laboratoire, distribuez 925 μL de chaque tampon dans la cuvette appropriée à l’aide des micropipettes étiquetées. Attention à ne pas utiliser la même pointe de pipette pour différents tampons.
- Une fois que vous avez terminé, ramenez les tampons sur votre établi. Là, placez une micropipette de 200 μL pour distribuer 75 μL et fixez une pointe à la micropipette.
- Distribuez 75 μL de rouge neutre dans chacune des neuf cuvettes tampons. Retournez chaque cuvette plusieurs fois pour bien mélanger les solutions. note: Replacez la pointe de la pipette si elle touche un tampon.
- Une fois que vous avez mélangé du rouge neutre avec chaque tampon, prenez une photo ou notez les couleurs des solutions.
- Allumez un spectrophotomètre portable et laissez la source lumineuse se réchauffer. Une fois qu’il est prêt, créez une nouvelle expérience pour mesurer l’absorbance en fonction de la longueur d’onde pour le rouge neutre libre.
- Insérez la cuvette d’eau désionisée et acquérez un spectre de l’eau désionisée. Réglez-le comme fond solvant ou blanc.
- Ensuite, retirez l’ébauche et insérez la cuvette de rouge neutre dans le tampon de pH le plus bas, qui aura la plus forte concentration de rouge neutre protoné.
- Acquérez un spectre, qui doit montrer un pic fort. Identifiez la longueur d’onde correspondant au point le plus haut de ce pic, ou au maximum. Enregistrez cette longueur d’onde dans votre cahier de laboratoire en tant que lambda max pour le rouge neutre libre protoné.
- Enregistrez les données et retirez la cuvette. Notez l’absorbance dans votre carnet, puis collectez les spectres pour les cuvettes 2 à 9 en utilisant la même procédure.
- Enregistrez la longueur d’onde du point isosbestique dans votre cahier de laboratoire. C’est là que tous les spectres se croisent à une seule longueur d’onde. Si un spectre ne se croise pas à ce moment-là, videz et nettoyez la cuvette, préparez un nouvel échantillon et réessayez.
- Une fois que vous avez terminé de collecter les spectres pour les neuf cuvettes, enregistrez et exportez les données.
- Créez une nouvelle expérience pour mesurer l’absorbance en fonction de la longueur d’onde pour le rouge neutre lié.
- Ajustez une nouvelle pointe à la micropipette de 200 μL et ajoutez 75 μL de solution de protéine de liaison à la riboflavine dans chaque cuvette, y compris l’ébauche. Éjectez l’embout, fixez les bouchons de la cuvette et retournez la cuvette plusieurs fois pour mélanger les solutions.
- Insérez la cuvette 10 dans le spectrophotomètre et réglez-la comme ébauche de solvant.
- Acquérez un spectre de l’échantillon de pH le plus bas, et identifiez la longueur d’onde correspondant au maximum du pic le plus intense. Enregistrez-le dans votre cahier de laboratoire en tant que lambda max de rouge neutre lié aux protonés.
- Acquérez les spectres pour les cuvettes 2 à 9 de la même manière que vous l’avez fait pour les échantillons de rouge neutre gratuits. Notez les intensités à lambda max pour le rouge neutre lié aux protonations dans votre tableau, ainsi que la longueur d’onde au point isosbestique.
- Lorsque vous avez terminé, enregistrez vos données, exportez-les pour une analyse ultérieure et éteignez le spectrophotomètre.
- Rangez tout le matériel et jetez vos pointes de pipette usagées dans un conteneur à déchets ou une poubelle approuvé.
- Videz les cuvettes dans le bécher à déchets tampons aqueux et rincez les cuvettes dans le bécher avec de l’eau déminéralisée.
- Videz l’excès de NaOH dans les déchets de base et rincez le cylindre gradué à l’eau.
- Jetez les déchets aqueux de base dans les égouts avec de l’eau du robinet en abondance, avec les autres déchets aqueux.
- Lavez votre verrerie, les bouchons de cuvette et le bar à agitation selon les procédures standard de votre laboratoire. Nettoyez vos surfaces de travail avec un essuie-tout humide et jetez les essuie-tout et les lingettes de laboratoire usagés à la poubelle du laboratoire.
Results
Analysons maintenant nos données d'absorbance pour déterminer les pKa du rouge neutre.

Tableau 3 : Détermination des pKa du rouge neutre

NRH⁺ gratuit Lié NRH⁺
λ_max (nm)
ΔA (nm)
Point médian (nm)
pKa

Cliquez ici pour télécharger le tableau 3
- Tracez les deux ensembles de données d’intensité avec l’intensité de l’absorbance à lambda max sur l’axe des y et le pH sur l’axe des x, avec les points reliés par des lignes lisses.
- Calcule la différence entre les intensités d’absorbance de début et de fin pour chaque série de données.
- Détermine l’absorbance à mi-chemin entre les absorbances de début et de fin pour chaque série, ou les points médians d’absorbance.
- Trouvez où se trouve le point médian sur chaque ligne et identifiez la valeur du pH à ce point. Ces valeurs de pH sont les pKa du rouge neutre libre et lié.
- Ici, nous voyons une augmentation du pKa d’environ un entre le rouge neutre libre et le rouge neutre lié, indiquant que le rouge neutre protoné lié est un acide plus faible que le rouge neutre protoné libre d’un ordre de grandeur.