Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Tampons

Notions clés Préparation de l’enseignant Protocole de l’étudiant

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Les tampons sont des solutions qui visent à maintenir un pH constant dans un système, indépendamment de l’ajout d’acides ou de bases forts. En l’absence de tampons, l’ajout d’un acide fort ou d’une base à une solution modifie considérablement le pH. Les tampons sont cruciaux dans la vie quotidienne. Par exemple, le sang agit comme un tampon et est capable de maintenir un pH entre 7,35 et 7,45, car un pH supérieur à 7,8 ou inférieur à 6,8 peut entraîner la mort.

Alors, comment fonctionne un tampon ? Un tampon est essentiellement un acide ou une base faible et sa base conjuguée ou un acide en équilibre les uns avec les autres. Prenons, par exemple, un tampon à base d’acide acétique et d’acétate de sodium. La solution tampon contient un acide faible et son sel conjugué, qui se dissocie pour former l’acétate de base conjuguée. La solution est acide car le K_a de l’acide acétique est supérieur au K_b de la base conjuguée.

N’oubliez pas que la constante de dissociation, K_a ou K_b, définit la force de l’acide ou de la base, respectivement, car il s’agit de la constante d’équilibre pour la dissociation du composé dans l’eau. La constante de dissociation peut également être représentée par pK_a, ou le log négatif de K_a, où plus le pK_a est petit, plus l’acide est fort. Il en va de même pour pK_b, où plus le pK_b est petit, plus la base est forte.

Pour en revenir au tampon d’acétate, si nous ajoutons une base forte, comme l’hydroxyde de sodium, les ions hydroxyde réagissent avec les ions hydronium présents dans la solution. Cela fait réagir plus d’acide acétique avec l’eau afin de revenir à l’équilibre, formant ainsi plus d’ions hydronium. Si nous ajoutons un acide fort, comme l’acide chlorhydrique, davantage d’ions hydronium se forment en solution. Ces ions réagissent avec les ions acétate pour former plus d’acide acétique. Dans les deux cas, il y a très peu de changement dans le pH de la solution.

Gardez à l’esprit que chaque tampon a une plage de pH spécifique où il peut tamponner une solution. Nous montrons ici une courbe de titrage pour notre tampon d’acide acétique. La plage de mise en mémoire tampon est mise en surbrillance. Cette région est déterminée par l’équation d’Henderson-Hasselbalch, qui nous dit que le pH du tampon est déterminé par le K_a de l’acide faible et le rapport de la base conjuguée à l’acide faible.

Loin de ce pH, l’acide faible ou la base du tampon est épuisé et il ne peut pas tamponner le pH. Ainsi, lorsque vous choisissez un tampon pour votre application, choisissez-en un dont le pK_a est proche du pH souhaité.

Enfin, tous les tampons ont une limite à leur capacité tampon, c’est-à-dire la quantité d’acide ou d’une base qui peut être ajoutée à la solution tampon avant que le pH ne change de manière significative. Par exemple, si nous ajoutons trop d’acide à notre solution tampon d’acide acétique et d’acétate de sodium, nous protonifierons tous les ions acétate et accumulerons beaucoup d’ions hydronium, abaissant ainsi le pH.

De même, si nous ajoutons trop de base, nous déprotonerons tout l’acide acétique et accumulerons beaucoup d’ions hydroxyde, augmentant ainsi le pH. Ainsi, la capacité tampon est influencée par la concentration de l’acide faible et du sel conjugué. Ainsi, un tampon en acétate de 1 molaire a une capacité tampon plus élevée qu’un tampon en acétate de 0,1 molaire.

Dans cet atelier, vous préparerez et examinerez des tampons avec une grande variété de plages de pH. Vous utiliserez ensuite vos tampons pour déterminer le pK_a d'un indicateur de pH, appelé rouge neutre, et explorerez le changement du pK_a du rouge neutre lorsque la protéine de liaison à la riboflavine est introduite.

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Source : Smaa Koraym de l’Université Johns Hopkins, MD, États-Unis

Préparation 50 mM NaH₂PO₄ Tampon, pH 7

Dans la première partie de cette expérience, vous préparerez une solution de phosphate de sodium tamponnée à pH 7,0. Le phosphate monosodique est un acide faible avec la base conjuguée, le phosphate disodique. Les solutions de phosphate monosodique non ajustées ont généralement un pH d’environ 4 à 6.

Les tampons sont plus efficaces près de leur pKa, qui est de 6,8 à 7,2 pour le phosphate monosodique. Ainsi, vous utiliserez le NaOH pour pousser l’équilibre vers la base conjuguée sans modifier la composition globale de l’équilibre tampon.

Avant de commencer l’expérience, calculez la masse de phosphate monosodique dont vous aurez besoin pour faire 200 mL d’une solution de 50 mM.

Tableau 1 : Préparation d’un tampon 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0

Masse molaire de NaH₂PO₄ = 119,98 g/mol
Volume de la solution (mL)	200
Molarité (mM)	50
Moles de NaH₂PO₄ (mol)
Masse nécessaire (mg)
Volume initial de 1 M de NaOH (mL)
Volume final de 1 M de NaOH (mL)
Volume de NaOH utilisé (mL)
Volume d’eau DI nécessaire (mL)

Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1

Pour commencer, enfilez l’équipement de protection individuelle nécessaire, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité résistantes aux éclaboussures et des gants. note: Cette section du laboratoire utilise du NaOH, qui est corrosif et toxique. Soyez prudent lorsque vous versez et transportez du NaOH.
Remplissez une bouteille de lavage en plastique de 250 ml avec de l’eau déminéralisée.
Étiquetez deux béchers de 100 ml, l’un pour les déchets aqueux neutres et l’autre pour les déchets aqueux basiques.
Étalonnez votre pH-mètre à l’aide des tampons fournis. Rangez la sonde dans sa solution de stockage lorsque vous avez terminé.
Tare le papier de pesée, et utilisez une spatule propre pour mesurer la quantité requise de phosphate monosodique selon vos calculs. Notez la quantité exacte de phosphate monosodique dans votre cahier de laboratoire. note: Le phosphate monosodique absorbe l’humidité de l’air, alors travaillez rapidement pour obtenir une mesure précise et fermez hermétiquement le récipient lorsque vous en avez terminé.
Placez le phosphate monosodique dans un bécher de 400 ml et nettoyez la spatule avec une lingette de laboratoire. Jetez le papier de pesée et la lingette de laboratoire avant de retourner dans votre hotte.
Utilisez un cylindre gradué pour mesurer 175 mL d’eau déminéralisée. Versez l’eau dans le bécher de phosphate monosodique et ajoutez un barreau d’agitation magnétique.
Agitez la solution jusqu’à ce que le sel soit complètement dissous et que la solution apparaisse homogène. Cela prend généralement 2 à 3 min.
Mesurez 15 ml d’eau déminéralisée et versez-le dans le bécher. Continuez à remuer la solution jusqu’à ce qu’elle apparaisse à nouveau homogène (environ 1 à 2 min). Éteignez le moteur d’agitation.
Rincez la sonde de pH avec de l’eau déminéralisée, puis fixez-la dans la solution avec le capteur au-dessus de la barre d’agitation.
Apportez un cylindre gradué de 10 ml et un verre de montre à la hotte de distribution et mesurez 10 ml de 1 M de NaOH. Notez le volume exact dans le cylindre gradué.
Couvrez votre NaOH avec le verre de la montre, et apportez-le soigneusement à votre hotte.
Reprendre l’agitation de la solution de phosphate monosodique. Tout en surveillant la lecture du pH, utilisez une pipette jetable pour ajouter lentement du NaOH à la solution d’agitation par gouttes. Une fois que le pH du tampon atteint 7,0, renvoyez le NaOH encore dans la pipette dans le cylindre gradué.
Calcule le volume de NaOH que vous avez ajouté au tampon. Soustrayez ce volume de 10 ml pour déterminer la quantité d’eau déminéralisée que vous devez ajouter à votre tampon pour atteindre un volume total de solution de 200 ml.
Mesurez l’eau déminéralisée avec un autre cylindre gradué de 10 ml et ajoutez-la à la solution d’agitation pour terminer la fabrication du tampon.
Rincez la sonde de pH avec de l’eau déminéralisée, couvrez-la avec le capuchon rempli de solution de stockage et débranchez ou éteignez la sonde.
Étiquetez une bouteille de polyéthylène de 250 ml comme 'tampon de phosphate monosodique de 50 mM, pH 7.0'. Récupérez la barre d’agitation magnétique de la solution.
Utilisez un entonnoir pour verser la solution tampon dans le flacon étiqueté et le boucher hermétiquement.

Spectroscopie d’absorption du rouge neutre libre et lié
Les tampons peuvent être utilisés pour évaluer les composés à des valeurs de pH spécifiques. Dans cette section, vous allez enregistrer le spectre d’absorbance de l’indicateur rouge neutre dans différents tampons. La forme protonée du rouge neutre est rouge et la forme déprotonée est jaune-orange, ce qui signifie qu’elles absorbent respectivement la lumière verte et bleu-violet. Ainsi, les formes acides et basiques ont des longueurs d’onde d’absorption distinctes. La liaison aux protéines modifie les propriétés du rouge neutre, modifiant à la fois son absorbance et son pKa.

Après avoir mesuré le spectre d’absorbance du rouge neutre libre à plusieurs valeurs de pH, vous ajouterez de la protéine de liaison à la riboflavine, ou RP, aux solutions et mesurerez à nouveau les absorbances. L’intensité de l’absorbance est liée à la concentration, vous utiliserez donc les spectres pour déterminer le pKa du rouge neutre libre et lié après le laboratoire.
- Dessine le tableau suivant dans ton cahier de laboratoire. Numérotez les cuvettes de 1 à 10 et énumérez les neuf valeurs de pH tampon que vous utiliserez. La 10ème cuvette sera une ébauche d’eau désionisée. note: Tenez toujours les cuvettes par les côtés texturés et essuyez les côtés transparents juste avant de mettre la cuvette dans le spectrophotomètre. N’oubliez pas d’aligner les côtés transparents avec le faisceau de lumière dans le spectrophotomètre.
  Tableau 2 : Absorbance du rouge neutre libre et lié
  
  Cuvette # Tampon pH Abs. à λ_max(NRH⁺ libre) Abs. à λ_max (NRH lié)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 vide
  Cliquez ici pour télécharger le Tableau 2
- Obtenez dix cuvettes et bouchons de 1,5 ml et étiquetez-les de 1 à 10 pour qu’ils correspondent à la table de votre cahier de laboratoire.
- Étiquetez un bécher de 25 ml comme 'DIH2O' et remplissez-le d’eau désionisée.
- Jetez vos déchets aqueux neutres dans le drain et renommez le bécher comme 'déchet tampon aqueux'.
- Étiquetez un bécher de 400 ml pour les pointes de micropipette utilisées.
- Fixez une pointe à une micropipette de 1 mL et utilisez-la pour distribuer 1000 μL d’eau déminéralisée dans la cuvette 10. Il s’agit de votre ébauche de solvant.
- Placez 925 μL de votre tampon de phosphate monosodique pH 7.0 dans la cuvette 5.
- Apporte les cuvettes vides restantes à la table de tampon. À l’aide de la table de votre cahier de laboratoire, distribuez 925 μL de chaque tampon dans la cuvette appropriée à l’aide des micropipettes étiquetées. Attention à ne pas utiliser la même pointe de pipette pour différents tampons.
- Une fois que vous avez terminé, ramenez les tampons sur votre établi. Là, placez une micropipette de 200 μL pour distribuer 75 μL et fixez une pointe à la micropipette.
- Distribuez 75 μL de rouge neutre dans chacune des neuf cuvettes tampons. Retournez chaque cuvette plusieurs fois pour bien mélanger les solutions. note: Replacez la pointe de la pipette si elle touche un tampon.
- Une fois que vous avez mélangé du rouge neutre avec chaque tampon, prenez une photo ou notez les couleurs des solutions.
- Allumez un spectrophotomètre portable et laissez la source lumineuse se réchauffer. Une fois qu’il est prêt, créez une nouvelle expérience pour mesurer l’absorbance en fonction de la longueur d’onde pour le rouge neutre libre.
- Insérez la cuvette d’eau désionisée et acquérez un spectre de l’eau désionisée. Réglez-le comme fond solvant ou blanc.
- Ensuite, retirez l’ébauche et insérez la cuvette de rouge neutre dans le tampon de pH le plus bas, qui aura la plus forte concentration de rouge neutre protoné.
- Acquérez un spectre, qui doit montrer un pic fort. Identifiez la longueur d’onde correspondant au point le plus haut de ce pic, ou au maximum. Enregistrez cette longueur d’onde dans votre cahier de laboratoire en tant que lambda max pour le rouge neutre libre protoné.
- Enregistrez les données et retirez la cuvette. Notez l’absorbance dans votre carnet, puis collectez les spectres pour les cuvettes 2 à 9 en utilisant la même procédure.
- Enregistrez la longueur d’onde du point isosbestique dans votre cahier de laboratoire. C’est là que tous les spectres se croisent à une seule longueur d’onde. Si un spectre ne se croise pas à ce moment-là, videz et nettoyez la cuvette, préparez un nouvel échantillon et réessayez.
- Une fois que vous avez terminé de collecter les spectres pour les neuf cuvettes, enregistrez et exportez les données.
- Créez une nouvelle expérience pour mesurer l’absorbance en fonction de la longueur d’onde pour le rouge neutre lié.
- Ajustez une nouvelle pointe à la micropipette de 200 μL et ajoutez 75 μL de solution de protéine de liaison à la riboflavine dans chaque cuvette, y compris l’ébauche. Éjectez l’embout, fixez les bouchons de la cuvette et retournez la cuvette plusieurs fois pour mélanger les solutions.
- Insérez la cuvette 10 dans le spectrophotomètre et réglez-la comme ébauche de solvant.
- Acquérez un spectre de l’échantillon de pH le plus bas, et identifiez la longueur d’onde correspondant au maximum du pic le plus intense. Enregistrez-le dans votre cahier de laboratoire en tant que lambda max de rouge neutre lié aux protonés.
- Acquérez les spectres pour les cuvettes 2 à 9 de la même manière que vous l’avez fait pour les échantillons de rouge neutre gratuits. Notez les intensités à lambda max pour le rouge neutre lié aux protonations dans votre tableau, ainsi que la longueur d’onde au point isosbestique.
- Lorsque vous avez terminé, enregistrez vos données, exportez-les pour une analyse ultérieure et éteignez le spectrophotomètre.
- Rangez tout le matériel et jetez vos pointes de pipette usagées dans un conteneur à déchets ou une poubelle approuvé.
- Videz les cuvettes dans le bécher à déchets tampons aqueux et rincez les cuvettes dans le bécher avec de l’eau déminéralisée.
- Videz l’excès de NaOH dans les déchets de base et rincez le cylindre gradué à l’eau.
- Jetez les déchets aqueux de base dans les égouts avec de l’eau du robinet en abondance, avec les autres déchets aqueux.
- Lavez votre verrerie, les bouchons de cuvette et le bar à agitation selon les procédures standard de votre laboratoire. Nettoyez vos surfaces de travail avec un essuie-tout humide et jetez les essuie-tout et les lingettes de laboratoire usagés à la poubelle du laboratoire.
Results
Analysons maintenant nos données d'absorbance pour déterminer les pKa du rouge neutre.

Tableau 3 : Détermination des pKa du rouge neutre

NRH⁺ gratuit Lié NRH⁺
λ_max (nm)
ΔA (nm)
Point médian (nm)
pKa

Cliquez ici pour télécharger le tableau 3
- Tracez les deux ensembles de données d’intensité avec l’intensité de l’absorbance à lambda max sur l’axe des y et le pH sur l’axe des x, avec les points reliés par des lignes lisses.
- Calcule la différence entre les intensités d’absorbance de début et de fin pour chaque série de données.
- Détermine l’absorbance à mi-chemin entre les absorbances de début et de fin pour chaque série, ou les points médians d’absorbance.
- Trouvez où se trouve le point médian sur chaque ligne et identifiez la valeur du pH à ce point. Ces valeurs de pH sont les pKa du rouge neutre libre et lié.
- Ici, nous voyons une augmentation du pKa d’environ un entre le rouge neutre libre et le rouge neutre lié, indiquant que le rouge neutre protoné lié est un acide plus faible que le rouge neutre protoné libre d’un ordre de grandeur.