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Source : Smaa Koraym de l’Université Johns Hopkins, MD, États-Unis
Dans la première partie de cette expérience, vous préparerez une solution de phosphate de sodium tamponnée à pH 7,0. Le phosphate monosodique est un acide faible avec la base conjuguée, le phosphate disodique. Les solutions de phosphate monosodique non ajustées ont généralement un pH d’environ 4 à 6.
Les tampons sont plus efficaces près de leur pKa, qui est de 6,8 à 7,2 pour le phosphate monosodique. Ainsi, vous utiliserez le NaOH pour pousser l’équilibre vers la base conjuguée sans modifier la composition globale de l’équilibre tampon.
| Masse molaire de NaH2PO4 = 119,98 g/mol | |
| Volume de la solution (mL) | 200 |
| Molarité (mM) | 50 |
| Moles de NaH2PO4 (mol) | |
| Masse nécessaire (mg) | |
| Volume initial de 1 M de NaOH (mL) | |
| Volume final de 1 M de NaOH (mL) | |
| Volume de NaOH utilisé (mL) | |
| Volume d’eau DI nécessaire (mL) | |
Les tampons peuvent être utilisés pour évaluer les composés à des valeurs de pH spécifiques. Dans cette section, vous allez enregistrer le spectre d’absorbance de l’indicateur rouge neutre dans différents tampons. La forme protonée du rouge neutre est rouge et la forme déprotonée est jaune-orange, ce qui signifie qu’elles absorbent respectivement la lumière verte et bleu-violet. Ainsi, les formes acides et basiques ont des longueurs d’onde d’absorption distinctes. La liaison aux protéines modifie les propriétés du rouge neutre, modifiant à la fois son absorbance et son pKa.
Après avoir mesuré le spectre d’absorbance du rouge neutre libre à plusieurs valeurs de pH, vous ajouterez de la protéine de liaison à la riboflavine, ou RP, aux solutions et mesurerez à nouveau les absorbances. L’intensité de l’absorbance est liée à la concentration, vous utiliserez donc les spectres pour déterminer le pKa du rouge neutre libre et lié après le laboratoire.
| Cuvette # | Tampon pH | Abs. à λmax (NRH+ libre) | Abs. à λmax (NRH lié) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | vide |
Analysons maintenant nos données d'absorbance pour déterminer les pKa du rouge neutre.
| NRH+ gratuit | Lié NRH+ | |
| λmax (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Point médian (nm) | ||
| pKa |
Cliquez ici pour télécharger le tableau 3
Dans la première partie de cette expérience, vous préparerez une solution de phosphate de sodium tamponnée à pH 7,0. Le phosphate monosodique est un acide faible avec la base conjuguée phosphate disodique. Les solutions de phosphate monosodique non ajustées ont généralement un pH d’environ 4 à 6.
Les tampons sont plus efficaces près de leur pKa, qui est de 6,8 à 7,2 pour le phosphate monosodique. Ainsi, vous utiliserez de l’hydroxyde de sodium pour pousser l’équilibre vers la base conjuguée sans altérer la composition globale de l’équilibre tampon. Avant de commencer le laboratoire, calculez la masse de phosphate monosodique dont vous aurez besoin pour fabriquer 200 millilitres d’une solution de 50 millimolaires.
Cette section du laboratoire utilise de l’hydroxyde de sodium, qui est corrosif et toxique. Soyez prudent lorsque vous versez et transportez de l’hydroxyde de sodium. Maintenant, commençons.
Tout d’abord, enfilez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité résistantes aux éclaboussures et des gants en nitrile. Ensuite, remplissez une bouteille de lavage en plastique de 250 millilitres avec de l’eau déminéralisée. Étiquetez deux béchers de 100 millilitres pour les déchets aqueux neutres et basiques, respectivement.
Ensuite, calibrez votre pH-mètre à l’aide des tampons fournis. Rangez la sonde dans sa solution de stockage lorsque vous avez terminé. Maintenant, apportez un bécher de 400 millilitres à la zone de la balance analytique pour obtenir le phosphate monosodique dont vous aurez besoin.
Tarez un morceau de papier pesée et utilisez une spatule propre pour mesurer la quantité requise de phosphate monosodique selon vos calculs. Le phosphate monosodique absorbe l’humidité de l’air, alors travaillez rapidement pour obtenir une mesure précise et fermez hermétiquement le récipient lorsque vous avez terminé. Notez la quantité exacte de phosphate monosodique que vous mesurez dans votre cahier de laboratoire.
Ensuite, placez le phosphate monosodique dans le bécher et nettoyez la spatule avec une lingette de laboratoire. Jetez le papier de pesée et la lingette de laboratoire avant de retourner dans votre hotte. Maintenant, utilisez un cylindre gradué pour mesurer 175 millilitres d’eau déminéralisée.
Versez l’eau dans le bécher de phosphate monosodique et ajoutez un barreau d’agitation magnétique. Remuez la solution sur une plaque à mélanger jusqu’à ce que le sel soit complètement dissous et que la solution apparaisse homogène. Cela prend généralement deux à trois minutes.
Ensuite, mesurez 15 millilitres d’eau déminéralisée avec un cylindre gradué. Versez l’eau déminéralisée dans le bécher et continuez à remuer la solution jusqu’à ce qu’elle apparaisse à nouveau homogène, ce qui prend généralement une à deux minutes. Ensuite, éteignez le moteur d’agitation.
Rincez la sonde de pH avec de l’eau déminéralisée, puis fixez-la dans la solution avec le capteur au-dessus de la barre d’agitation. Maintenant, apportez un cylindre gradué de 10 millilitres et un verre de montre à la hotte de distribution, et mesurez 10 millilitres d’hydroxyde de sodium à 1 molaire. Couvrez votre hydroxyde de sodium avec le verre de la montre et apportez-le soigneusement à votre hotte.
Notez le volume exact dans le cylindre gradué. Ensuite, recommencez à agiter la solution de phosphate monosodique. Tout en surveillant la lecture du pH, utilisez une pipette jetable pour ajouter lentement de l’hydroxyde de sodium à la solution d’agitation de manière goutte à goutte.
Une fois que le pH du tampon atteint 7,0, remettez l’hydroxyde de sodium encore dans la pipette dans le cylindre gradué. Ensuite, calculez le volume d’hydroxyde de sodium que vous avez ajouté à partir des volumes initial et final dans le cylindre gradué. Soustrayez ce volume de 10 millilitres pour déterminer la quantité d’eau déminéralisée que vous devez ajouter à votre tampon pour atteindre un volume total de solution de 200 millilitres.
Mesurez l’eau déminéralisée dont vous avez besoin avec un autre cylindre gradué de 10 millilitres et ajoutez-la à la solution d’agitation pour terminer la fabrication du tampon. Rincez la sonde de pH avec de l’eau déminéralisée, couvrez-la avec le capuchon rempli de solution de stockage et débranchez ou éteignez la sonde. Après cela, étiquetez une bouteille de polyéthylène de 250 millilitres comme tampon de phosphate monosodique de 50 millimolaires, pH 7,0. Utilisez une pince pour récupérer la barre d’agitation magnétique de la solution.
Ensuite, placez un entonnoir dans l’embouchure de la bouteille et versez la solution tampon dans la bouteille. Retirez l’entonnoir et fermez bien la bouteille. Vous êtes maintenant prêt à passer à la section spectroscopie d’absorption.
Les tampons peuvent être utilisés pour évaluer les composés à des valeurs de pH spécifiques. Dans cette section, vous allez enregistrer le spectre d’absorbance de l’indicateur rouge neutre dans différents tampons. La forme protonée du rouge neutre est rouge et la forme déprotonée est jaune-orange, ce qui signifie qu’elles absorbent respectivement la lumière verte et bleu-violet.
Ainsi, les formes acides et basiques ont des longueurs d’onde d’absorption distinctes. La liaison aux protéines modifie les propriétés du rouge neutre, modifiant à la fois son absorbance et son pKa. Après avoir mesuré le spectre d’absorbance du rouge neutre libre à plusieurs valeurs de pH, vous ajouterez de la protéine de liaison à la riboflavine, ou RP, aux solutions et mesurerez à nouveau les absorbances.
L’intensité de l’absorbance est liée à la concentration, vous utiliserez donc les spectres pour déterminer le pKa du rouge neutre libre et lié après le laboratoire. Avant de commencer cette section, dessinez un tableau dans votre cahier de laboratoire, indiquant le numéro de cuvette, le pH tampon, l’absorbance à lambda max pour le rouge neutre protoné libre et l’absorbance à lambda max pour le rouge neutre protoné lié. Numérotez les cuvettes de 1 à 10 et énumérez les neuf valeurs de pH tampon que vous utiliserez.
La 10ème cuvette sera une ébauche d’eau désionisée. Tenez toujours les cuvettes par les côtés texturés et essuyez les côtés transparents juste avant de mettre la cuvette dans le spectrophotomètre. N’oubliez pas d’aligner les côtés transparents avec le faisceau de lumière dans le spectrophotomètre.
Maintenant, commençons. Procurez-vous dix cuvettes et bouchons de 1,5 millilitre, et étiquetez-les de 1 à 10 pour qu’ils correspondent à la table de votre cahier de laboratoire. Étiquetez un bécher de 25 millilitres comme DIH2O' et remplissez-le d’eau désionisée.
Ensuite, jetez vos déchets aqueux neutres dans les égouts et réétiquetez le bécher en tant que déchet tampon aqueux. Ensuite, fixez une pointe à une micropipette de 1 millilitre et utilisez-la pour distribuer 1000 microlitres d’eau déminéralisée dans la cuvette 10. Ce sera votre ébauche de solvant.
Maintenant, éjectez l’embout, réglez la micropipette pour distribuer 925 microlitres et fixez un nouvel embout. Placez 925 microlitres de votre tampon de phosphate monosodique pH 7,0 dans la cuvette cinq. Éjectez la pointe et bouchez la cuvette.
Ensuite, apportez les cuvettes vides restantes à la table tampon. À l’aide de la table de votre cahier de laboratoire, versez 925 microlitres de chaque tampon dans la cuvette appropriée à l’aide des micropipettes étiquetées. Attention à ne pas utiliser la même pointe de pipette pour différents tampons.
Une fois que vous avez terminé, ramenez les tampons sur votre établi. Là, placez une micropipette de 200 microlitres pour distribuer 75 microlitres et fixez une pointe à la micropipette. Maintenant, procurez-vous une fiole ou un tube de solution rouge neutre, qui peut être partagé avec un autre groupe d’étudiants.
Distribuez 75 microlitres de rouge neutre dans chacune des neuf cuvettes tampons. Replacez la pointe de la pipette si elle touche un tampon. Éjectez l’embout de la pipette et bouchez les cuvettes lorsque vous avez terminé.
Maintenant, retournez chaque cuvette plusieurs fois pour bien mélanger les solutions. Une fois que vous avez mélangé du rouge neutre avec chaque tampon, prenez une photo ou notez les couleurs des solutions. Ensuite, allumez un spectrophotomètre portable et attendez que la source lumineuse se réchauffe.
Une fois qu’il est prêt, créez une nouvelle expérience pour mesurer l’absorbance en fonction de la longueur d’onde pour le rouge neutre libre. Ensuite, insérez la cuvette d’eau déminéralisée. Obtenez un spectre de l’eau déminéralisée et définissez-le comme fond de solvant ou blanc.
Ensuite, retirez l’ébauche du spectrophotomètre et insérez la cuvette de rouge neutre dans le tampon de pH le plus bas, qui aura la plus forte concentration de rouge neutre protoné. Acquérez un spectre, qui doit montrer un pic fort. Identifiez la longueur d’onde correspondant au point le plus haut de ce pic, ou au maximum.
Enregistrez cette longueur d’onde dans votre cahier de laboratoire en tant que lambda max pour le rouge neutre libre protoné. Enregistrez les données et retirez la cuvette. Notez l’absorbance dans votre cahier, puis collectez les spectres des cuvettes 2 à 9 en utilisant la même procédure.
Les spectres doivent tous se croiser en un seul point, appelé point isosbestique. Enregistrez la longueur d’onde de ce point dans votre cahier de laboratoire. Si un spectre ne se croise pas à ce moment-là, videz et nettoyez la cuvette, préparez un nouvel échantillon et réessayez.
Une fois que vous avez terminé de collecter les spectres des 9 cuvettes, enregistrez et exportez les données. Ensuite, créez une nouvelle expérience pour mesurer l’absorbance en fonction de la longueur d’onde pour le rouge neutre lié. Ajustez une nouvelle pointe à la micropipette de 200 microlitres et obtenez un récipient partagé de protéine de liaison à la riboflavine.
Ajoutez 75 microlitres de solution protéique de liaison à la riboflavine dans chaque cuvette, y compris le blanc. Éjectez l’embout, fixez les bouchons de la cuvette et retournez la cuvette plusieurs fois pour mélanger les solutions. Maintenant, insérez la cuvette 10 dans le spectrophotomètre et réglez-la comme ébauche de solvant.
Ensuite, acquérez un spectre de l’échantillon au pH le plus bas et identifiez la longueur d’onde correspondant au maximum du pic le plus intense. Enregistrez-le dans votre cahier de laboratoire en tant que lambda max de rouge neutre lié aux protonés. Après cela, acquérez les spectres pour les cuvettes 2 à 9 de la même manière que vous l’avez fait pour les échantillons de rouge neutre libre.
Notez les intensités à lambda max pour le rouge neutre lié aux protonations dans votre tableau, ainsi que la longueur d’onde au point isosbestique. Lorsque vous avez terminé, enregistrez vos données, exportez-les pour une analyse ultérieure et éteignez le spectrophotomètre. Rangez les micropipettes, les boîtes à pointes, le pH-mètre et le spectrophotomètre.
Jetez vos pointes de pipette usagées dans une poubelle ou une poubelle approuvée. Maintenant, videz les cuvettes dans le bécher à déchets tampons aqueux et rincez les cuvettes dans le bécher avec de l’eau déminéralisée. Dans votre hotte, videz l’excès d’hydroxyde de sodium dans les déchets de base et rincez le cylindre gradué à l’eau.
Rincez les déchets aqueux de base dans les égouts avec de l’eau du robinet en abondance, avec les autres déchets aqueux. Lavez votre verrerie, vos bouchons de cuvette et votre barre d’agitation conformément aux procédures standard de votre laboratoire. Enfin, nettoyez vos surfaces de travail avec une serviette en papier humide et jetez les serviettes en papier et les lingettes de laboratoire usagées à la poubelle du laboratoire.
Analysons maintenant nos données d’absorbance pour déterminer les pKa du rouge neutre. Tout d’abord, tracez les deux ensembles de données d’intensité avec l’intensité d’absorbance à lambda max sur l’axe des y et le pH sur l’axe des x, avec les points reliés par des lignes lisses. Ensuite, pour chaque série de données, calculez la différence entre les intensités d’absorbance de début et de fin.
Utilisez cela pour calculer l’absorbance à mi-chemin entre les absorbances de début et de fin de chaque série, ou les points médians d’absorbance. Maintenant, trouvez où se trouve le point médian sur chaque ligne et identifiez la valeur du pH à ce point. Ces valeurs de pH sont les pKa du rouge neutre libre et lié.
Ici, nous voyons une augmentation de pKa d’environ 1 entre le rouge neutre libre et le rouge neutre lié, indiquant que le rouge neutre protoné lié est un acide plus faible que le rouge neutre protoné libre d’un ordre de grandeur.
