Chromatographie en colonne

chromatographie en colonne

Il existe de multiples techniques pour purifier et séparer les composés dans un laboratoire de chimie organique. L’une des techniques de séparation les plus fiables pour les séparations à l’échelle microscopique, où moins de 10 grammes du composé sont disponibles pour l’analyse, est la chromatographie sur colonne. Cette technique sépare les composés d’un mélange en fonction de leurs propriétés physiques, telles que leur solubilité, leur polarité, leur hydrophobie, leur taille et leur charge.

Bases de la chromatographie

Les principaux composants de tout système de chromatographie sont la phase stationnaire, la phase mobile et le mélange d’échantillons à analyser. Dans la chromatographie sur colonne, la phase stationnaire est généralement constituée de billes à l’échelle microscopique, qui sont emballées uniformément dans une colonne verticale. Un écoulement continu de la phase mobile, également connu sous le nom de solvant, est ajouté au sommet de la colonne, qui s’écoule à travers la phase stationnaire par gravité ou à un débit contrôlé par une pompe.

L’échantillon est dissous dans une petite quantité de solvant, puis ajouté au sommet de la colonne. Plus de solvant est ajouté pour forcer l’échantillon à s’écouler à travers la phase stationnaire. Les composés du mélange se répartissent entre la phase mobile et la phase stationnaire en fonction de leurs propriétés différentes et forment des bandes discrètes.

Les composés ayant de fortes interactions avec la phase stationnaire se déplaceront plus lentement que les composés ayant de faibles interactions avec la phase stationnaire. Ainsi, les composés à interactions faibles sortiront de la colonne, ou élué, plus tôt que ceux à interactions fortes. L’intensité de l’interaction d’un composé avec la phase stationnaire est définie par le facteur de retard (R_f), qui est le rapport entre la distance parcourue par un composant et celle parcourue par la phase mobile. Le facteur de retard est déterminé en effectuant d’abord une chromatographie sur couche mince.

Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). Génie des bioprocédés, concepts de base. Upper Saddle River, NJ : Prentice Hall.

La chromatographie sur colonne est une technique qui utilise une colonne garnie pour séparer les composés en fonction de leurs interactions avec une phase stationnaire, qui se présente généralement sous la forme de billes microscopiques. Les espaces entre les billes sont remplis de solvant. L’ouverture de la colonne permet au solvant de s’écouler à travers la phase stationnaire. Lorsqu’un mélange est appliqué sur le dessus de la colonne garnie, suivi d’une plus grande quantité de solvant, le mélange passe à la phase mobile et s’écoule à travers la phase stationnaire.

Chaque composant du mélange interagit avec la phase stationnaire d’une manière différente. Certains composants ont de faibles interactions avec la phase stationnaire et se déplacent donc rapidement dans la colonne, tandis que d’autres ont de fortes interactions avec la phase stationnaire et se déplacent donc plus lentement. Cela sépare les différents composés en bandes, qui sont collectées en petites fractions. Cela permet la purification de chaque composé.

Alors, quels types de propriétés peuvent être utilisés pour séparer les mélanges ? L’une des propriétés les plus couramment utilisées est la polarité. Pour cela, le gel de silice, qui est une forme de dioxyde de silicium, est souvent utilisé comme phase stationnaire. Le gel de silice interagit avec les composés par des interactions dipôle-dipôle et une liaison hydrogène par le biais des groupes -OH qui se forment à sa surface. Ainsi, les composés polaires interagissent fortement avec la phase stationnaire, tandis que les composés non polaires interagissent faiblement.

D’autres propriétés qui peuvent être exploitées pour la séparation comprennent la taille, la charge et l’hydrophobie. Une façon courante de charger la phase stationnaire dans la colonne est de la transformer en suspension de la phase stationnaire et du solvant. Ensuite, la phase stationnaire est remplie en faisant circuler plus de solvant à travers la colonne pour compacter la boue. Il est essentiel que la phase stationnaire soit emballée uniformément sans bulles d’air, canaux vides ou zones sèches. Ceux-ci peuvent perturber le flux et provoquer un mélange de bandes.

Lors du choix d’une colonne, le diamètre est basé sur le volume de l’échantillon à séparer. L’échantillon doit recouvrir le haut de la colonne d’une couche mince et uniforme. Une couche d’échantillon plus épaisse conduit à des bandes plus larges. La longueur de la colonne dépend de la façon dont les composés se séparent sur la phase stationnaire. Les composés ayant des affinités similaires pour la phase stationnaire nécessitent une longue colonne pour une séparation adéquate. Cependant, un mélange de composés ayant des affinités très différentes pour la phase stationnaire peut être séparé sur une colonne plus courte.

Dans cet atelier, vous explorerez la chromatographie sur colonne en emballant et en préparant d’abord une colonne de gel de silice. Ensuite, vous utiliserez votre colonne pour séparer les composants colorés dans un colorant alimentaire vert.