Summary
여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Zebrafish는 오래 살아있는 투명한 배의 시간이 경과 이미징에 의해 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하기 위해 이용되었다. 여기 우리는 장기 이미징을위한 zebrafish의 배아를 탑재하고 공촛점 현미경을 사용하여 시간 경과 이미지 캡처를 자동화하는 방법을 보여주는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 두 개의 광자 현미경에 장착된 femtosecond 레이저의 초점을 맞춘 전력을 사용하여 zebrafish에 주변 감각 axons의 개별 지점 관리, 정확한 손상을 만드는 방법을 설명합니다. 성공적인 두 광자 axotomy 대한 매개 변수는 각 현미경에 최적화된해야합니다. 두 가지 예제를 제공하기 위해 사용자 정의 내장된 두 개의 광자 현미경 및 자이스 혈구 510 공촛점 / 두 광자 모두 두 광자 axotomy을 설명합니다.
Zebrafish 삼차 감각 뉴런은 감각 뉴런 특정 발기인 1 구동 유전자 변형 라인 표현 GFP에 시각하실 수 있습니다. 우리는 직접 zebrafish 배아 생활 감각 축삭 재생을 관찰하기 위해이 zebrafish 삼차 모델을 적응있다. 배아는 tricaine와 anesthetized하고 그것이 굳은로 아가로 오스의 드롭 내에 위치. 고정 배아는 phenylthiourea (PTU) 링거스 가득 이미징 챔버 내에 봉인하고 있습니다. 우리는 배아가 지속적으로 12~48시간 이러한 실에서 몇 군데 수있는 것으로 나타났습니다. 하나 공촛점 이미지 다음 axotomy의 원하는 사이트를 결정하기 위해 캡처합니다. 관심 지역은 이미징 낮은 비 피해 전원에서 감각 axons하여 두 광자 현미경에 위치하고 있습니다. axotomy의 원하는 위치에 확대 후, 전원이 증가하고 정의된 지역의 한 검사는 축삭을 끊을 수있는 충분한입니다. 여러 장소 시간 저속 영상 그러면 바로 부상에서 axonal 회복을 관찰할 수 공촛점 현미경에 설정됩니다.
Protocol
1 부 : 장기 이미징 장착 zebrafish의 배아
- 삽입을위한 1퍼센트 낮은 용해 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 작은 튜브와 섭씨 42 도에 가열 블록에 저장에 전자렌지, 나누어지는에서 가열하여 DI 물의 아가로 오스를 디졸브.
- 이미징을위한 배아를 선택하고 부드럽게 집게로 분리 chorion를 당기는하여 chorions를 제거합니다. 배아는 색소의 형성을 억제하기 위해 22-24시간 포스트 수정 (HPF)에서 5 % PTU 링거스 솔루션에 삽입할 수 있습니다. 이것은 영상의 선명도를 향상시키고 감각 axons의 2 광자 axotomies를 수행하는 것이 필수적입니다. 자연 색소가 양식을 수있다면, autofluorescence는 두 광자 현미경에 axons를 가린다. zebrafish에 대한 솔루션은 116 MM NaCl, 2.9 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5mM HEPES, pH를 7.2이 포함되어 있습니다 링거스.
- PTU 링거스에 ~ 0.02 % tricaine을 추가하여 배아를 마취. 확실히 동물이 진행하기 전에 터치에 반응하지 않습니다하십시오.
- 유리 또는 테플론 반지의 한쪽으로 진공 그리스를 적용하고 유리 커버 슬립에 그것을 고정하여 장기 이미징 챔버를 준비합니다.
- 많은 PTU 링거스의를 전송하지를 돌보는 유리 pipet으로 42도 아가로 오스 솔루션을 하나의 배아를 전송, 다음 준비 커버 슬립에 아가로 오스 중 하나를 드롭으로 배아를 전송합니다.
- 아가로 오스는 견고처럼 원하는 배아를 놓습니다. 작업이 완료되면 이미지 챔버가 커버 슬립이 상단 표면되도록 뒤집힌 것입 것을 명심하십시오.
- 당신은 전동 무대를 한번에 이미지를 여러 위치에 수, 반복은 각 배아에 대한 1.4-1.6 단계를하십시오.
- 아가로 오스가 완전히 응고 허용, 다음 0.02 % tricaine PTU 링거스와 함께 반지를 입력합니다.
- 유리 슬라이드와 함께 반지 (들)을 커버 후, 링 (들)의 반대쪽에 진공 그리스를 적용합니다. 이상 밀봉된 챔버 (들)을 뒤집기. 이 챔버는 직립하거나 거꾸로 현미경에서 이미지 사용할 수 있습니다.
2 부 : 카멜레온 티 - 사파이어 레이저로 맞춤 내장된 두 광자 현미경을 사용하여 두 광자의 axotomy
- 이미지 준비. 현미경 슬라이드 홀더에 장착 배아 (들)을 놓으십시오. 40X (NA 0.8) 물 객관적인 하나의 배아에 중점을두고 있습니다. 레이저를 켭니다. 우리는 reproducibly 시각화 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 뉴런을 표현하는 GFP를 손상 수있다. 비 피해 전력 axons을 시각화하기 위해 910 나노미터의 파장 (NM)와 30 전력 (MW가 나와있는 예제에서 권력의 금액) 밀리 와트로 레이저를 설정합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 우리는 카렐 스보보다의 연구실 2, 3에서 개발된 ScanImage 소프트웨어를 사용합니다.
- 두 광자 레이저로 배아를 검색하도록 초점을 누르면, 당신이 axotomize하고자하는 축삭을 찾아,이 축삭의 이미지를 캡처합니다. 처음이자 마지막 Z 위치를 마크 이미지를 획득하고, Z 스택의 최대 투영합니다.
- 당신이 스캔을 axotomize 및 중지하고자하는 축삭의 가지에 70X 확대. 180 MW의 손상 전원 샘플에서 MW를 증가하고, 레이저로 단일 스캔을 수행합니다. 우리는 1 Z의 조각의 개수를 설정하고 "잡아"를 눌러이 작업을 수행. 이것은 축삭을 도려 충분해야합니다. 당신의 현미경과 실험적인 목표에 대해이 절차를 최적화하는 방법에 대한 논의를 참조하십시오.
- , 축소 30 MW로 전력을 줄이고 이미지를 가져가라.
파트 3 : 자이스 혈구에서 두 광자 axotomy 510 공촛점 / 두 광자 현미경
- 장소는 무대에 배아를 탑재하고 25X 물이 목적 또는 기타 적합한 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고.
- 그것은 하나에서 다른로 전환 가능 있도록 두 개의 광자 (910 NM)와 아르곤 (488 NM) 멀티 - 트랙 설정에서 레이저를 켜십시오. 두 레이저가 GFP를 검색하는 데 사용되지만, 두 광자 방출 빨간색과 시각이며, 녹색과 아르곤 레이저 방출이 두 가지를 구별합니다.
- 다치게하는 축삭을 확인하기 위해 아르곤 레이저를 사용합니다. Z 아래 설정은 처음이자 마지막 광학 섹션을 표시합니다. 공촛점 이미지를 가지고 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다.
- 부상으로 축삭의 지역을 선택과 집중에이 지역을 가지고. 아르곤 레이저를 끄고 두 광자 레이저를 켜십시오. 축삭 초점 아직 있는지 ~ 9 %의 전송의 레이저 강도에서 두 광자로 표본을 검사합니다.
- 자르기 도구를 사용할 수 있도록 "중지"버튼을 클릭하십시오. 관심의 영역을 확대하기 위해 작물을 사용합니다. 보통 우리는 ~ 70X (확대가 "모드"탭에서 확인할 수 있습니다)로 확대할 수 있습니다. "채널"탭 아래 15~20%의 전송 ~ 9 %의 전송에서 두 광자의 강도를 변경합니다.
- 축삭을 도려하면 여분의 손상을 방지하려면 정지 버튼을 누르면 약 1 초 후과에 대해 "빠른 XY"버튼을 활성화합니다. 프로 시저가 작동하는 경우 축삭은 흩어져 파편으로 간주되어야합니다.
- 보장하기 위해 그 축삭488 nm의 아르곤 레이저로 다시 전환 손상되었다, 다른 공촛점 이미지를 가지고, 최대 프로젝션을 만듭니다.
4 부 : 자이스 혈구 LSM 510에 공촛점 시간 저속 영상
- 이미지 준비. 당신은 열띤 무대를 사용하는 경우, 시간 경과 영화를 설정하기 전에 최소한 30 분 거리에 그것을 설정해야합니다. 현미경 슬라이드 홀더에 장착 배아 (들)을 놓으십시오. 원하는 공기 목적 하나의 배아에 중점을두고 있습니다. 우리는 20X, 0.5 NA 목표를 사용합니다. 오픈 자이스 혈구 LSM 510 이미징 소프트웨어. 적절한 레이저의 전원을 켜고 원하는 구성을 설정합니다. 우리는 지금 자이스 혈구 LSM 멀티 타임 소프트웨어와 함께 장기적인 이미지에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 방법은 이미징 소프트웨어를 자신의 현미경에 사용하기 위해 적용할 수 있습니다.
- 멀티 타임 윈도우에서 처음으로 배아의 위치 및 구성을 정의합니다. 스캔, 무대, 그리고 멀티 시간 창을 엽니다. 빠른 검색 창에서 검색을 활성화합니다. 원하는 XY 위치로 무대를 이동합니다. 스캔 윈도우에서 처음이자 마지막 Z 위치를 표시합니다. 또한, 검색 창에서, 다음 중순 중지를 누르십시오. 완료 중간 Z 슬라이스의 스캔을 위해 잠깐, 다음 단계 창의 마크 위치를 누르십시오. 하나의 배아만을 이미징하는 경우, 다중 시간 창에서 "단일 위치 '탭을 클릭하십시오. "교체 XYZ"을 클릭 후 "구성 저장". 이전 구성을 덮어쓸 것인지 물었을 때 동의합니다. 4.4 단계로 진행합니다. 당신이 기계 무대를 갖고있다면, 이미지 여러 배아 여러 위치를 설정할 수 있습니다. 이 경우, 당신은 첫 번째 위치를 XYZ 및 구성을 정의하기 전에 "여러 위치 '탭을 선택합니다. 또한, "여러 위치 '탭 아래의 풀다운 메뉴가 위치 1되었는지가, 그리고가 설정 저장을 클릭하기 전에 구성 섹션의 풀다운 메뉴, LOC 1 멀티 말하고.
- 멀티 시간 윈도우에 남아있는 태아의 위치 및 구성을 정의합니다. 다음 배아를 찾은 후, 빠른 스캔을 눌러 원하는 위치에 XY 스테이지를 이동하고, 검사 창에서 처음이자 마지막 Z 위치를 표시합니다. 또한, 검색 창에서, 다음 중순 중지를 누르십시오. 완료 중간 Z 슬라이스의 스캔을 위해 잠깐, 다음 단계 창의 마크 위치를 누르십시오. "교체 XYZ '을 클릭하십시오. "구성 저장"을 누른 다음 구성 섹션의 풀다운 메뉴가 멀티 LOC이 말하는 것은 그저 '여러 위치'탭 아래의 풀다운 메뉴가 위치 2 있는지 확인합니다. 이전 구성을 덮어쓸 것인지 물었을 때 동의합니다. 남은 배아에 대해이 과정을 반복합니다.
- 다중은 Loc 윈도우에서 이미지 수집을위한 매개 변수를 설정합니다. "블록의 목록"섹션에서 GR - GL 옵션을 선택한 다음, 그룹 반복의 원하는 번호를 입력합니다. 이것은 공촛점 각 위치에서 이미지를 획득됩니다 횟수입니다. 매개 변수 섹션에서 원하는 대기 간격을 입력합니다. 이것은 하나의 영상 반복의 시작에서 다음 반복의 시작 시간의 금액입니다. 구성 섹션의 "ZStackXY"를 선택하십시오. 당신에게 아래 섹션에서 기본 파일 이름을 입력합니다. "을 선택 이미지 DB"를 클릭하여 MDB를 선택하십시오. '옵션'버튼을 클릭하십시오. 임시 파일을 저장하여 MDB 폴더를 선택합니다. "최종 이미지를 저장"및 "Z 스택의 중간", "최종 이미지가 뜨고 '확인하십시오. 간격을 기다 선택합니다. 옵션 창을 닫습니다. "시작 시간"을 클릭합니다. 이미지의 기간 동안 멀티 시간 창문을 열어 둡니다.
- 데이터를 분석할 수 있습니다. 시간 경과 이미징가 완료되면, 멀티 시간 소프트웨어는 임시 파일의 각 위치에 대한 요약 파일에 모두 컴파일됩니다. 당신이 완료되기 전에 동영상을 막으려면 요약 파일이 생성됩니다 그래서, "그만하세요"대신 "Finish"를 누르십시오. 임시 파일 및 요약 파일은 자동으로 지정 MDB 폴더에 저장해야합니다. LSM 소프트웨어 메뉴에서 "프로젝션"다음 "3D보기"를 클릭하십시오. 풀다운 메뉴에서 선택한 요약 파일과 함께, "적용"을 클릭하십시오. 이것은 각각의 공촛점 이미지의 Z 스택의 최대 추정치를 생성합니다. LSM 소프트웨어 메뉴에서 '내보내기', '파일'을 클릭하십시오. TIF 파일의 일련의 최대 예상을 저장합니다. 그런 다음 ImageJ 또는 QuickTime Pro를 사용 TIF 파일의 일련의 밖으로 영화를 만들 수 있습니다. LSM 이미지에 Axons은 축삭의 형태에 대한 자세한 양적 정보를 생성하는 이미지 분석 소프트웨어 (MicroBrightfield에서 예 NeuroLucida)를 사용하여 3 차원에 추적할 수 있습니다.
제 5 부 : 대표 결과
성공적인 실험은 세포 역동의 정확한 표현 발생합니다부상에서 축삭 복구의 S. 당신의 배아가 눈에 띄는 변성과 강한 심장 박동과 함께, 영상 후 건강한 것입니다. axotomy은 축삭의 정의 지점 severing, 정확한 손상을해야합니다. 주변 axons와 최소한의 세포 죽음에 아무런 부상이 없어야합니다. 우리는 직접 실험 ~ 50 % axotomy의 사이트에 단일 표피 세포의 죽음을 볼 수 믿습니다. 더 많은 손상을 관찰하면 토론에 설명한 바와 같이, 당신은 두 광자 프로토콜을 최적화해야합니다.
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Discussion
우리는 정확하게 주변 감각 axons을 axotomize하고 직접 생활 zebrafish 배아에서 재생을 관찰하는 설명 방법을 사용했습니다. zebrafish에서 장기 시간이 경과 공촛점 영상은 생체내 많은 발달 과정을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 설명한 두 광자 axotomy 절차는 여러 실험 목표 수정할 수 있습니다. 우리는 휴대폰 본체보다는 주변 축삭의 가지에 확대하여 전체 삼차 신경 감각 세포의 시체를 ablate에 동일한 일반적인 절차를 사용합니다. 형광과 식별 모든 세포 유형은 정확하게 손상되거나 femtosecond 레이저의 초점을 맞춘 파워 ablated 수 있습니다. 우리는 펄스 레이저가 지역화된 손상을 만들거나 세포 4,5,6을 ablate하는 데 사용되었습니다 여러 다른 시스템에서 이전 연구하여 zebrafish 시스템에 이러한 기술을 완벽하게 맞출 수 있었다. 제어 실험에서 우리는 axotomy 매우 정확한 확인 : 우리는 그들이 같은 세포의 가지 경우에도, 가까운 axons를 손상하지 않으며 부득 이한 경우에만 axons에 가까운 병렬 배치의 상피 세포를 손상 적이있다. 이 특이성은 두 광자 레이저 여기에서 강도가 초점 3,7에서 거리로 quadratically 가져오고있다는 사실에 의해 설명하실 수 있습니다. 흥분 형광단에서 방출되는 에너지는 photodamage에 기여 이후 또한, 주변의 레이블이 지정되지 않은 세포는 살아남지 가능성이 있습니다.
축삭 손상하는 데 필요한 레이저의 파워는 레이저, 조직의 깊이 및 실험 목표까지 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 당신은 배 (胚)의 깊이 axons 손상을 원하시면, 더 많은 전력이 필요합니다. 낮은 전력에서 axotomy을 시도하고 축삭을 끊을 것이다 금액을 찾을 때까지 다음 점차적으로 전원을 증가하는 것이 좋습니다. 일단 axotomy에 대한 레이저의 파워의 해당 금액을 결정 있고, 당신은 reproducibly 지방 조직 손상을이 레이저 전원을 사용할 수 있어야합니다. 당신은 시간이 지남에 더 많은 전원이 axotomy을 만들 필요하다고 통지하면, 레이저 및 현미경 (예를 들어, 레이저 정렬 밖으로있을 수 있습니다) 유지 보수를 요구할 수 있습니다. 귀하의 레이저가 제대로 정렬되어 있는지 확인하여 목표를 청소하고, 거울을 확인합니다.
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Acknowledgments
우리는 현지 시간 저속 영상에 대한 장착에 대한 조언을 조직 손상, 캐시 Joubin 및 토론을위한 Sagasti 및 Portera - Cailliau 실험실을 생성하기 위해 두 광자 현미경을 사용하여 초기 조언 마크 데라 사키 감사합니다. 초기 실험은 우즈 홀, MA에있는 해양 생물 연구소에서 그라스 재단 연구원처럼 의해 수행되었다. Sagasti 실험실 작업은 화이트홀 재단 Klingenstein 재단, 그리고 생명 공학 버로우즈 웰컴 기금 경력 수상의 보조금에 의해 지원되었다.
References
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