En fractionnement subcellulaire in situ des cellules de mammifères sur des lamelles de microscope permet la visualisation de la localisation des protéines.
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Article de méthode
En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fonction des protéines est intimement couplée à la localisation des protéines. Bien que certaines protéines sont limités à un endroit précis ou un compartiment subcellulaire, de nombreuses protéines sont présentes en tant que population librement diffusant dans le libre-échange avec une sous-population qui est étroitement associé à un domaine particulier ou d'une structure subcellulaire. En fractionnement subcellulaire in situ permet la visualisation de compartimentation de protéines et peut aussi révéler des protéines sous-populations qui localisent à des structures spécifiques. Par exemple, la suppression des protéines solubles dans le cytoplasme et lâchement protéines nucléaires peut révéler l'association stable de certains facteurs de transcription à la chromatine. Après la digestion de l'ADN peut dans certains cas révéler association avec le réseau de protéines et d'ARN qui est collectivement appelés le nucléaire échafaudage ou de la matrice nucléaire.
Nous décrivons ici les étapes nécessaires au cours des fractionnement in situ de adhérentes et cellules non adhérentes de mammifères sur des lamelles de microscope. La visualisation des protéines peut être réalisée en utilisant des anticorps spécifiques ou des protéines de fusion fluorescentes et la microscopie à fluorescence. Les anticorps et / ou des colorants fluorescents qui agissent comme des marqueurs pour les compartiments spécifiques ou des structures permettant la localisation des protéines à être cartographié en détail. En fractionnement in situ peut également être combiné avec Western blot pour comparer les quantités de protéines présentes dans chaque fraction. Cette approche simple biochimiques peuvent révéler des associations qui seraient autrement inaperçus.
Protocole
I. Préparation pour le fractionnement
Cette section décrit la préparation de poly-L-Lysine lamelles de microscope enduit et la fixation des cellules avant de fractionnement. Si nécessaire, les cellules peuvent être transitoirement transfectées avec des vecteurs d'expression de protéines avant ou après la fixation.
A. Préparation de poly-L-Lysine lamelles revêtement
- Préparer une solution de 1mg/ml poly-L-lysine dans l'eau distillée.
- Lamelles pelage propre à la poly-L-Lysine en les incubant dans la solution pendant au moins 1 heure sur une plate-forme à bascule à 22 ° C.
- Lavez les la....
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Discussion
Les problèmes courants et suggestions:
Tous ou la plupart des cellules sont perdues pendant le lavage. Pendant les étapes liquides de lavage doit être ajouté lentement sur le côté de la plaque de 6 puits en évitant la lamelle. De même les liquides doivent être enlevés par attentivement inclinant la plaque et lentement pipetage hors excès de liquide. L'adhésion cellulaire peut être augmentée en utilisant la poly-L-Lysine lamelles enrobées.
L'ADN génomique est.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Anyaporn Sawasdichai et Nazefah Abdul Hamid sommes reconnaissants envers le gouvernement royal thaïlandais et le Gouvernement de la Malaisie, respectivement, pour un doctorat Bourses. Ce travail a été financé par une subvention du Wellcome Trust de projet attribué à PSJ et KG. Nous sommes également reconnaissants à l'Université de Bristol Facilité Bioimaging Wolfson.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Produit chimique | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Produit chimique | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Produit chimique | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsine | Produit chimique | |||
| EGTA | Produit chimique | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Formaldéhyde | Produit chimique | VWR | 284216N | |
| PIPES | Produit chimique | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Saccharose | Produit chimique | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Produit chimique | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Milieu de montage avec DAPI | Produit chimique | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Réactif de transfection Fugene 6 | Produit chimique | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Anticorps | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamine A/C | Anticorps | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubuline-α | Anticorps | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
Références
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S.
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Réimpressions et autorisations
