Ce protocole est un extrait de Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Préparation des larves
- Deux jours ou plus avant le début de l’essai, établir des croisements des combinaisons expérimentales et témoins souhaitées (minimum 20 femelles et 10 mâles chacun) dans des boîtes de ponte telles que décrites par Wieschaus et Nusslein-Volhard, mais à l’aide de béchers en polypropylène de 50 ml et de boîtes de Pétri jetables de 6,0 cm contenant de la gélose à raisin et enduites de pâte de levure juste avant l’utilisation. Conservez les mouches dans les plats de ponte dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Recette de gélose au raisin – mélanger 100 ml de concentré de jus de raisin 100 % congelé, 350 ml d’eau déminéralisée, 5 ml d’acétique glacial et 13 g de gélose D. melanogaster dans un bécher en verre de 1 L. Cuire au micro-ondes par rafales de 1 à 2 minutes, en remuant entre les rafales, jusqu’à ce que la gélose soit entièrement dissoute. Refroidir la solution pendant quelques minutes, puis ajouter 10 ml de 10 % (p/v) de Nipagen (méthyl-p-hydroxybenzoate) dans de l’éthanol à 95 %. Mélanger, puis pipeter 7 mL par assiette dans des boîtes de Pétri jetables de 6,0 cm, laisser gélifier et sécher à température ambiante pendant 3-4 h. Conserver à 4 °C dans des sacs en plastique.
- Recette de pâte de levure – 7 g de levure sèche, 10 ml d’eau déminéralisée, mélanger à la spatule jusqu’à consistance uniforme.
- Collectes d’œufs chronométrées pour générer des larves expérimentales et témoins. À l’aide d’assiettes à raisin neuves et enduites de levure, recueillir les œufs à température ambiante pendant 4 h dans l’obscurité pendant les heures du matin. Retirez ces plaques de collecte de 4 h et remplacez-les par des plaques neuves. Incuber les plaques de collecte de 4 h pendant la nuit à 25 °C jusqu’à l’après-midi du lendemain, lorsque la plupart des larves auront éclos. Collectez ces larves du premier stade et utilisez-les pour mettre en place l’expérience.
2. Mise en place des plaques de dosage
- Préparation des plaques de dosage. Pour une seule série d’essais, préparez cinq plaques d’essai de 10 larves expérimentales chacune et cinq plaques de 10 larves témoins. À l’aide d’un foreur de liège de 1,5 cm, retirez un noyau central de gélose de chaque assiette, créant ainsi un trou pour la nourriture. Mettez de la pâte de levure (0,8 - 0,9 g) dans le trou et tapotez doucement avec une spatule pour faire un monticule remplissant le trou.
- Préparation de la plaque de gélose – mélanger 700 ml d’eau déminéralisée avec 16 g de gélose D. melanogaster dans un bécher en verre de 2 L et cuire au micro-ondes pendant 5 min. Retirer du micro-ondes et remuer avec une tige de verre pour incorporer la gélose non dissoute dans la solution. Ajouter 17,5 mL de Nipagen à 10 % (p/v) dans de l’éthanol à 95 %, mélanger, puis poursuivre le chauffage au micro-ondes par rafales de 30 s suivies d’une agitation, jusqu’à ce que toute la gélose soit complètement dissoute. Laissez refroidir pendant une minute ou deux, puis pipetez 15 mL d’aliquotes dans des boîtes de Pétri en plastique de 10 cm. Laissez gélifier l’agar, couvrez les assiettes avec des couvercles et laissez-les sécher à température ambiante pendant quelques heures ou toute la nuit. Stocker les assiettes dans des sacs en plastique scellés à 18 °C.
NOTE 1 : Pour éviter la formation de cristaux Nipagen à la surface des plaques en raison d’une dessiccation excessive, utilisez les plaques dans les quelques jours suivant la préparation. Si nécessaire, les cristaux peuvent être re-dissous en y déposant quelques microlitres d’alcool à 95 %.
NOTE 2 : les lots de gélose peuvent avoir différentes propriétés gélifiantes. Les plaques de gel sec doivent être fermes au toucher et suffisamment résistantes pour qu’un cercle de gélose propre et intact puisse être retiré lors de l’utilisation du foreur de liège pour créer le trou de nourriture (voir ci-dessus).
- Mise en place des larves dans des plaques d’essai. Utilisez une pression mécanique pour courber l’extrémité d’une microspatule en plastique et trempez l’extrémité dans de la pâte de levure pour fournir un « adhésif » pour ramasser les larves. Ramassez les larves du premier stade individuellement et placez-les sur la plaque de gélose près du monticule de nourriture. Préparez au moins cinq plaques répétées de 10 larves pour les génotypes expérimentaux et témoins. Une fois terminé, bouchez et étiquetez chaque assiette et placez les plaques (couvercle vers le haut) dans un endroit sombre à température ambiante (dans notre laboratoire, il fait 22 °C).
3. Surveillance des plaques de dosage
- Examinez les plaques tous les jours à l’aide d’un microscope à dissection et notez le nombre de larves sur la nourriture ou à la surface de la gélose. Notez toute larve morte ou mourante visible. Notez quand et si l’on observe un creusement de galeries dans le substrat de la gélose lorsque les larves se déplacent vers le troisième stade. Notez les dates auxquelles les pupes commencent à se former et notez toute anomalie nymphale. Continuez les observations quotidiennes jusqu’à ce que toutes les larves soient mortes ou nymphosées.
- Retirez délicatement les pupes de l’assiette à l’aide d’une aiguille à taquineries pliée et transférez-les dans une assiette à raisin. Si vous le souhaitez, continuez à surveiller les pupes pour déterminer combien d’entre elles sont à l’âge adulte.
