Extraction d’ADN à partir d’un clip de queue : une méthode utilisée dans le génotypage du poisson-zèbre

Résumé

Source : Xing L., et al. Génotypage rapide et efficace du poisson-zèbre à l’aide de la PCR avec analyse de fonte à haute résolution. J. Vis. Exp. (2014).

Cet article décrit l’extraction de l’ADN du clip de queue de poisson zèbre. Le protocole démontre une méthode rapide et efficace pour analyser les génotypes du poisson-zèbre.

Protocole

1. Préparation de l’ADN

1. Préparez le tampon de lyse de l’ADN : 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3 % Tween 20, 0,3 % NP40. Ajouter de la protéinase K fraîche à une concentration finale de 1 mg/ml le jour de l’utilisation.
2. Prélèvement de tissus :
   1. Pour une pince à nageoires de poisson adulte :
      1. Anesthésie le poisson : Placez le poisson dans une solution de MS-222 (tricaïne) à 0,004 %. Attendez que le mouvement des branchies ralentisse.
      2. Mettez le poisson sur une pile de 5 à 10 Kimwipes et coupez un petit morceau de la nageoire caudale, d’environ 2-3 mm, avec une lame de rasoir stérile.
      3. Placez rapidement le poisson dans un réservoir étiqueté avec de l’eau douce pour la récupération ; étiquetez soigneusement le réservoir et le tube correspondant qui contiendra l’attache de la nageoire. Changez l’eau et nourrissez les poissons tous les deux jours.
      4. Prenez l’aileron à l’aide d’une pointe de pipette stérile et transférez-le dans un tube rempli d’un tampon de lyse d’ADN de 100 μl.
      5. Jetez la pointe de la pipette et jetez la lame de rasoir dans un récipient pour objets tranchants.
   2. Pour le clip de queue d’embryon :
      1. Placez les embryons dans une solution de MS-222 (tricaïne) à 0,004 %. Attendre 2 min.
      2. Coupez un morceau de queue avec une pince sous un microscope à dissection.
      3. Placez la queue dans un tube étiqueté rempli d’un tampon de lyse d’ADN de 30 μl.
      4. Placez rapidement l’embryon dans un tube contenant 100 μl de paraformaldéhyde à 4 %.
      5. Étiquetez les tubes contenant des embryons et leurs tubes de queue correspondants.
      6. Conservez les tubes contenant les embryons à 4 °C pendant la nuit pour la fixation.
      7. Nettoyez la pince à l’aide d’eau Milli-Q et de lingettes Kimwipes entre chaque embryon pour minimiser la contamination.
   3. Pour les embryons entiers :
      1. Placez les embryons dans une solution de MS-222 (tricaïne) à 0,004 %. Attendre 2 min.
      2. Mettez 1 à 5 embryons dans un tube rempli de 100 μl de tampon de lyse d’ADN. La déchorionation n’est pas nécessaire.
3. Digestion de l’ADN
   Incuber des tubes avec de la soie (pinces à nageoires ou à queue ou embryons) à 55 °C pendant 4 heures jusqu’à toute la nuit.
4. Inactiver la protéinase K
   Les tubes chauffants à 95 °C pendant 15 min. L’ADN doit être utilisé immédiatement pour la PCR ou stocké à -20 °C jusqu’à 3 mois.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaïne
paraformaldéhyde