Implantation guidée par ultrasons : une technique pour implanter des cellules d’adénocarcinome canalaire pancréatique dans une souris adulte

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire jolive.

1. Préparation préopératoire des souris

REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer cette étape 24 heures avant l’intervention.

1. Placez les cages contenant des souris expérimentales sur un réchaud réglé à 37°C.
2. Procurez-vous de nouvelles cages propres et placez-les sur une deuxième plate-forme chauffante réglée à 37°C.
3. Nettoyez soigneusement l’enceinte de sécurité biologique, la chambre d’induction et la platine d’échographie (US) avec un stérilisant (voir tableau des matériaux).
4. Réglez la fonction de réchauffement de l’étage américain à 37°C.
5. Allumez l’appareil d’anesthésie : ajustez les cadrans sur le séparateur de tubes de manière à ce que le flux d’air soit limité à la chambre d’induction uniquement. Allumez le réservoir d’oxygène et réglez-le sur le débit à 1 L/min. Allumez le vaporisateur d’isoflurane à 2-3
 %.
6. Placez une seule souris dans la chambre d’induction. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle ne soit plus mobile et que la respiration ait ralenti.
7. Ajustez les cadrans du séparateur de manière à ce que le flux d’air soit autorisé à la fois vers la chambre d’induction et le cône nasal. Déplacez rapidement la souris de la chambre d’induction et posez-la en position ventrale sur la scène chaude des États-Unis avec son museau dans le cône nasal.
8. Testez le niveau d’induction en observant toute réponse réflexe au pincement des orteils. S’il n’y en a pas, la souris est prête pour l’épilation.
9. Placez une petite quantité de lubrifiant pour les yeux (voir le tableau des matériaux) sur les deux yeux pour éviter la déshydratation des tissus. Tournez la souris de manière à ce qu’elle repose en position dorsale sur la scène. Collez doucement les membres supérieurs et inférieurs à la scène avec du ruban adhésif afin de maximiser l’exposition de l’abdomen et de fixer la souris à la scène.
10. À l’aide d’un coton-applicateur stérile, appliquez une couche généreuse de crème dépilatoire sur le quadrant supérieur gauche de l’abdomen. L’épilatoire doit être appliqué dans la zone générale de la rate et s’étendre vers la ligne médiane. Laisser reposer environ une minute.
11. Testez le degré d’épilation en utilisant doucement l’extrémité opposée de l’applicateur à embout en coton pour essuyer la crème dépilatoire, une fois qu’elle s’enlève facilement, essuyez l’abdomen avec un tampon de gaze sec. Ensuite, mouillez une couche propre de gaze avec une petite quantité de solution saline chaude et essuyez à nouveau la zone pour éliminer complètement l’agent dépilatoire. Ne dépassez pas 2 minutes complètes de contact direct sur la peau de la souris afin de réduire le risque de brûlures chimiques.
12. Une fois que les poils ont été suffisamment retirés de l’abdomen, remettez la souris dans une nouvelle cage propre sur le réchaud.
13. Alors que le premier animal subit une épilation sur la scène américaine, l’animal suivant peut être ajouté à la chambre d’induction.
14. Avant d’anesthésier la prochaine cage de souris, éteignez l’isoflurane et rincez la chambre d’induction avec de l’oxygène. Nettoyez la chambre d’induction et l’étage US/cône nasal avec un stérilisant. Répétez les étapes 1.5-1.14 jusqu’à ce que toutes les cages et souris aient subi une épilation.
    note: On peut envisager de réduire au minimum l’obstruction visuelle des organes abdominaux due à des aliments non digérés dans l’estomac et les intestins (12 à 24 heures) chez les animaux à jeun par retrait temporaire de la nourriture pendant une période antérieure à l’implantation. La restriction d’eau n’est pas recommandée. Si les animaux sont à jeun, il est recommandé de les traiter avec une injection de 1 ml de solution saline chaude (37°C), stérile après l’injection de la tumeur afin de prévenir la déshydratation.

2. Implantation de cellules PDA guidée par ultrasons

REMARQUE : Toutes les procédures d’échographie sont effectuées à l’aide d’un appareil d’imagerie par ultrasons et d’un logiciel (voir Tableau des matériaux). Le transducteur a une fréquence centrale de 40 MHz et une bande passante de 22-55 MHz.

1. Ajustez la plate-forme d'échographie de manière à ce que la surface de la plate-forme soit parallèle au sol et que l'enquêteur fasse face au côté gauche de l'animal, avec la tête de l'animal vers la droite. Ajustez la position de la sonde de manière à obtenir une image abdominale transversale (Figure 1A).
2. Anesthésie la souris à injecter comme décrit aux étapes 1.1 à 1.8. Stabilisez la souris sur la plate-forme américaine comme décrit à l’étape 1.9.
3. Appliquez une quantité généreuse de gel à ultrasons chaud (37°C) sur la partie glabre de l’abdomen.
4. Abaissez doucement le transducteur pour qu’il entre en contact avec l’abdomen de la souris. Ajustez le transducteur au besoin jusqu’à ce que le pancréas soit clairement visible. Localisez le rein gauche et la rate afin de fournir une orientation précise de la cavité abdominale.
   note: Comme la position du transducteur a été modifiée pour permettre l’accès au côté gauche de l’abdomen, les axes X et Y sur les commandes de la platine sont maintenant inversés.
5. Chargez une seringue à insuline de 29 G x 1/2 " (voir le tableau des matériaux) avec 25 μL de suspension de cellules tumorales. Essuyez la pointe de l’aiguille avec un tampon de préparation à l’alcool stérile avant l’injection afin de minimiser l’ensemencement de cellules tumorales dans la paroi abdominale.
6. À l’aide d’une pince à bord émoussé, saisissez la peau et la paroi péritonéale pour augmenter la tension au site d’injection souhaité. En tenant la seringue à un angle d’environ 25° à 45° par rapport à la surface de la plate-forme d’échographie, faites lentement avancer l’aiguille à travers la peau et la paroi péritonéale. Vérifiez que l’aiguille a percé la paroi péritonéale avant de passer à l’étape suivante. Un petit pop doit être ressenti lorsque l’aiguille perce la paroi péritonéale.
7. Sous la visualisation par échographie, guidez l’aiguille directement dans le pancréas (Figure 1B-C). Vérifiez que l’aiguille se trouve dans le tissu pancréatique en déplaçant doucement le corps de la seringue de haut en bas. Si le placement est correct, la pointe de l’aiguille restera dans le tissu pancréatique pendant que le corps de la seringue se déplace.
8. Injectez lentement les cellules tumorales et confirmez que les cellules sont implantées à l’endroit souhaité par la formation d’un bolus de liquide dans le pancréas (visible sur l’écran d’échographie, Figure 1D).
   note: Une certaine résistance doit être ressentie en appuyant sur le piston. Veillez à ne pas percer le pancréas plusieurs fois, car cela augmente le risque de fuite dans la cavité abdominale.
9. Une fois que tout le volume de suspension a été injecté et qu’un bolus de liquide est visible dans le pancréas, maintenez l’aiguille très immobile pendant plusieurs secondes. Rétractez lentement l’aiguille de l’abdomen de la souris, en prenant grand soin de ne pas déranger les cellules injectées.
10. Placez la souris dans une cage propre et chaude et assurez-vous qu’elle se remet complètement de l’anesthésie. Répétez ce processus pour tous les animaux.
11. Avant d’anesthésier la souris suivante, nettoyez la chambre d’induction et le cône de la scène/du nez avec un stérilisant.
12. Répétez les étapes 2.2 à 2.11 jusqu’à ce que toutes les souris aient été injectées.

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