Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation

Résumé

Nous décrivons une méthode pour visualiser plusieurs reprises la microglie et les monocytes circulants murin In vivo Pendant des heures, jours ou semaines à l'aide transcrânienne microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une fenêtre amincie crâne qui permet l'observation intermittente de la microglie quiescente qui peut être activé par injection stéréotaxique adjacentes de la Tat du VIH-1 protéine régulatrice.

Résumé

Traditionnellement, dans les neurosciences, l'imagerie in vivo deux photons du système nerveux central murin a soit impliqué l'utilisation d'open-crâne ^1,2 ou amincie crâne ³ préparations. Alors que la technique du crâne ouvert est très polyvalent, il n'est pas optimal pour l'étude de la microglie, car elle est invasive et peut provoquer l'activation microgliale. Même si l'approche éclaircis-crâne est peu invasive, le re-répété amincissement du crâne requises pour l'imagerie chronique augmente les risques de lésion des tissus et l'activation de la microglie et permet à un nombre limité de séances d'imagerie. Nous présentons ici une méthode window chroniques mince crâne pour le suivi des microglies murins in vivo sur une période prolongée de temps en utilisant microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une société stable, accessible, amincie crâne fenêtre corticale (TSCW) avec une lamelle de verre revêtue de ce qui reste translucide sur le cours de trois semaines d'observation intermittente. Cette préparation est beaucoup plus TSCW immunologiquement inertes à l'égard de l'activation microgliale que craniotomie ouverte ou le crâne répétées amincissement et permet un nombre arbitraire de sessions d'imagerie au cours d'une période de quelques semaines. Nous préparons TSCW dans CX ₃ CR ₁ GFP / + ⁴ souris pour visualiser les microglies avec la protéine fluorescente verte améliorée à ≤ 150 um sous la surface piales. Nous montrons également que cette préparation peut être utilisée en conjonction avec des injections cérébrales stéréotaxiques de la protéine HIV-1 Tat neurotoxiques, adjacent à la TSCW, qui est capable d'induire microgliose durables. Par conséquent, cette méthode est extrêmement utile pour examiner les changements dans la morphologie et la motilité microgliales au fil du temps dans le cerveau vivant dans des modèles de troubles neurocognitifs associés au VIH (main) et d'autres maladies neurodégénératives ayant une composante neuro-inflammatoires.

Protocole

1. Préparer l'animal pour l'imagerie

1. Dans nos expériences, nous utilisons les adultes CX ₃ CR ₁ souris GFP / + qui expriment la GFP dans des lignées de cellules mononucléaires, y compris les microglies. ⁴ différentes souches de souris peut être utilisée pour répondre aux besoins d'un projet spécifique.
2. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale d'un cocktail de trois médicaments comprenant de 0,05 mg / kg de fentanyl, 5,0 mg / kg de midazolam, et 0,5 mg / kg médétomidine. ⁵ préparation chirurgicale pour TSCW commence après que l'animal ne réagit plus aux stimuli douloureux, comme comme un pincement de la queue. Tout au long de la chirurgie et l'imagerie, nous gardons l'animal sur un coussin chauffant pour éviter l'hypothermie post-anesthésie. Si nécessaire, une dose de rappel d'un tiers de la dose initiale du cocktail anesthésiant peut être donnée pour restaurer le plan d'origine anesthésique.
3. Couvrir les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique de protection de garder les yeux humides pendant l'anesthésie, ce qui supprime réflexe de clignement de l'animal. Retirez les cheveux du cuir chevelu de l'animal à l'aide d'un rasoir, ciseaux, les ciseaux, ou des méthodes chimiques. Désinfecter le cuir chevelu avec un 10% de povidone iodée solution et 70% d'éthanol. Tous les instruments chirurgicaux doivent être autoclavés, stérilisés avec un stérilisateur perles de verre, ou désinfectée avec de l'éthanol à 70%.
4. Faire une incision médiane du cuir chevelu à l'aide de petits ciseaux, en commençant 4-5 mm caudale du crâne et de faire progresser vers l'avant à l'avant des yeux. Il est important que cette incision être suffisamment long pour que la peau ne pas interférer avec le collage de la plaque de tête qui est utilisée pour stabiliser la tête de la souris pendant deux photons d'imagerie (figure 1). Identifier la zone à être éclaircis sous un microscope à dissection. Éviter les zones d'intérêt directement situé sur les sutures crâniennes, que le crâne est moins stable dans ces domaines et sous-jacente de grands navires et les méninges vont interférer avec l'imagerie.
5. Appliquer l'éthanol à 100%, suivi par solution à 10% de chlorure ferrique avec un coton tige stérile pour sécher les membranes sur le dessus du crâne et les gratter avec une pince fine ou une lame de rasoir. Le défaut de supprimer les résultats des membranes dans l'attachement tête de plaque instable.
6. Placez une fine couche de colle à l'Permabond 910 sur les bords de la fenêtre de visualisation sous la plaque la tête. Placer la plaque de tête enduite de colle sur la zone d'intérêt sur le crâne de l'animal avec une légère pression (figure 1). Il est important que la plaque de tête est seulement collé à l'os du crâne. Toute la peau ou des membranes qui sont coincés entre la plaque de tête et le crâne va diminuer la stabilité de la liaison. Appliquez une petite quantité d'acrylate autour de la fenêtre de visualisation utilisant une seringue pour instantanément obligataires de la colle. Enfin, appliquez une petite quantité de Loctite 454 sur les bords de la fenêtre de visualisation pour éviter les fuites.
7. Vissez la plaque de tête au détenteur des animaux (figure 1) et vérifier la stabilité de la plaque de tête sous un champ de dissection par une légère sondage avec une paire de pinces. Il devrait y avoir aucun mouvement du crâne par rapport à la plaque de tête. Déposer une goutte de solution saline sur la fenêtre de visualisation pour s'assurer qu'il n'ya pas de fuites.

2. Préparation de la Fenêtre Crâne Diluée corticale

1. En préparation pour fluidifier le crâne, le crâne sec en utilisant une combinaison de coton-tiges stériles et d'air comprimé. Nous avons d'abord éclaircir le crâne avec un peu stérile, l'IRF forage de 007 dans une perceuse Microtorque II a fixé à 4000 rpm. Très doucement, commencer amincissement une zone de 2 à 2,5 mm de diamètre circulaire du crâne. Utilisez uniquement des mouvements de balayage de lumière presque parallèle au crâne; ne pas utiliser une pression directe vers le bas. Arrêter le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d'os à l'aide de l'air comprimé. Ces ruptures dans le forage permettent le crâne pour se rafraîchir il n'ya donc pas de dommages induits par la chaleur dans le tissu cérébral sous-jacent.
   1. Comme le forage progresse, l'avis de la transition vers la couche d'os spongieux humides (ie le "diploé"). Une fois cette couche est atteinte, faire preuve de prudence supplémentaire avec la perceuse.
2. Vérifiez occasionnellement la minceur du crâne en plaçant une solution saline au cours de la zone amincie et la visualisation sous le microscope à dissection. Saline permettra en outre la dissipation thermique. Comme le crâne est aminci, les petits vaisseaux sanguins deviennent visibles.
3. Utilisez un microlames stériles dentaire pour atteindre la finale d'éclaircie dans une solution saline, comme le microlames fournit une rétroaction beaucoup plus tactile sur la stabilité du crâne. Cela permet des préparations beaucoup plus mince que le forage seul. De notre expérience, l'épaisseur du crâne optimale est de 10-30 um.
   1. Il est important de vérifier la minceur du crâne sous épifluorescence plusieurs fois pendant les premières tentatives à faire quelques une fenêtre du crâne minces. La netteté et la profondeur de la microglie et les vaisseaux visibles donnent une bonne indication quant au moment où la fenêtre est prêt pour l'imagerie.
4. Une fois la fenêtre est prêt, coller un morceau sur-mesure rectangulaire de # 0 lamelle wi e une dimension de moins de 2 mm de chaque côté sur la fenêtre. Avec une pipette de 1,0 mm de diamètre en verre, placer une petite goutte de colle cyanoacrylate sur la zone du crâne aminci et soigneusement bas le petit morceau de lamelle, puis appuyez doucement sur le crâne pour faire sortir l'excédent de la colle. Il est important d'éviter la formation de bulles entre le verre et la colle car l'air piégé va provoquer la zone sous pour devenir opaques. La colle cyanoacrylate est utilisé parce qu'il reste transparent lorsqu'il est sec et empêche également les os et repousse la membrane gardant le crâne sous la fenêtre mince et translucide. S'il n'y a pas de colle sur le dessus du couvercle en verre, utilisez la microlames soigneusement enlever une fois le couvercle en verre est en place et la colle est sèche.
5. Un analgésique (par exemple, buprénorphine 2 mg / kg sous-cutanée) est administré immédiatement après la chirurgie et ré-administrées à tout signe de douleur, notamment la réticence à se déplacer, manger ou boire, perte de poids, la salivation, horripilation, bruits respiratoires, etc

3. Deux photons d'imagerie

1. En préparation pour l'imagerie à deux photons, couvrir les TSCW avec une solution saline et de localiser la zone d'intérêt sous épifluorescence (Figure 2). Afin de permettre l'imagerie ultérieure de la zone, prendre une photo en utilisant un appareil photographique.
2. Pour l'imagerie à deux photons, nous utilisons une mesure faite microscope à deux photons ⁶ avec un Ti: Sapphire laser accordé à 920 nm. La fluorescence est détectée en utilisant un tube photomultiplicateur en mode de détection tout-terrain et un filtre d'émission 580/180. Une immersion dans l'eau 20X optique (0,95 NA) est utilisé tout au long de la séance d'imagerie. La puissance maximale de la puissance du laser à l'objectif est fixé entre 50 et 65 mW.
3. Sélectionnez un domaine d'intérêt dans les couches corticales I ou II (jusqu'à 150 um dessous de la surface piales). Afin de faciliter la ré-imagerie, de prendre des photos d'un même champ de vue à 1x, 2x et zoom numérique 3X. Les vaisseaux sanguins peuvent servir de repères pour trouver facilement le même champ de vision durant les séances d'imagerie ultérieurs. En vertu d'un zoom de 3x, plusieurs z-piles avec 80-90 Z-étapes dans chaque pile et une étape 0,69 um peuvent être acquis toutes les 5 minutes pendant 30 minutes, ce qui permet un bon échantillonnage de la morphologie de la microglie et les comportements au fil du temps ( Figure 3). Entre acquisitions de z-piles, on devrait vérifier le niveau de solution saline au cours de la TSCW, ainsi que la profondeur de l'animal de l'anesthésie.

4. L'injection de la neurotoxine VIH-1, Tat

1. Tout d'abord, silaniser la doublure intérieure d'une aiguille de calibre 35 et une seringue de 10 uL microvolume pour éviter le dépôt de Tat. Retirer la solution de silanisation (Sigmacote) jusqu'à ce qu'elle remplisse les deux aiguilles et de seringues. Laisser la solution reposer pendant 5 minutes à température ambiante. Videz la solution de la seringue, retirez le piston, et permettre à la seringue et l'aiguille de sécher complètement. Enfin, laver la seringue et l'aiguille avec de l'eau déminéralisée.
2. Effectuer une craniotomie petite 0,5 mm de diamètre, soit 3 mm rostrale ou latérales au TSCW où deux photons images ont été obtenues en utilisant un peu plus petit foret et soin amincissant le crâne jusqu'à une paire de pinces avec des conseils pointus peuvent enlever la couche amincie de osseux détache facilement. Nous utilisons une seringue de 10 uL microvolume équipé d'une aiguille de calibre 35 commandé par une pompe seringue Ultramicropump III monté sur un micromanipulateur 3-axes et après alignant l'aiguille de la craniotomie, il est soigneusement avancés à une profondeur de 700 à 900 um ci-dessous la surface piales où 3 uL Tat _1-72 (ou d'autres agents pro-inflammatoires) ou une solution saline (ou d'un véhicule de contrôle) est livrée à 80 Nl / min.

5. Logement des animaux

1. Si l'animal est à imager plusieurs fois en une seule journée, couvrir la zone ouverte du crâne avec un mélange de pommade ophtalmique et de la vaseline pour éviter la gêne ou de dommages au crâne entre les séances d'imagerie. Débranchez le pont le soutien de la tête petite plaque (voir figure 1B) et placer l'animal dans une cage réchauffé avec de la nourriture facilement accessible et l'eau. Tous les animaux doivent être logés séparément après la chirurgie, à tout moment. Une fois les séances d'imagerie pour un animal sont complets pour un jour donné, retirez soigneusement toute la tête de plaque et suture la peau du dos sur le crâne avec des n ° 6 ou plus petits de suture. Encore une fois, la maison des animaux individuellement avec de la nourriture facilement accessible et l'eau entre les jours d'expérimentation. Vérifiez les animaux tous les jours pour des signes de stress, la douleur, ou une infection.

6. Les résultats représentatifs

Figure 1. Stabilisation de l'animal pour la chirurgie et l'imagerie à deux photons (A) et la conception de plaque de tête (B).

Figure 2. GFP-étiquetée microglie visualisées avec épifluorescence.

jove_content ">
Figure 3. GFP-étiquetée microglie visualisées avec l'imagerie à deux photons après l'implantation de l'TSCW, environ 50 um dessous de la surface piales. La seule à deux photons sections prises 15-30 minutes après l'implantation de l'TSCW (jour 0), ainsi que 7 et 17 jours plus tard, de démontrer que les fenêtres tout reste clair microglie reste inactivé en l'absence d'insultes inflammatoires. Le Z-projections prises 6 et 24 heures après l'injection du VIH neurotoxine tat impressionnante exposition des changements morphologiques des cellules microgliales activées. Barre d'échelle: 10 um.

Discussion

Il ya un consensus croissant que le substrat réel pour le VIH-1 déficits neurocognitifs associés (MAIN) est la destruction de l'architecture synaptique, probablement causée par médiateurs pro-inflammatoires libérés de VIH-1 phagocytes mononucléaires. L'activation microgliale, des cellules géantes multinucléées, et gliose due à une hypertrophie astrocytaire sont considérés comme caractéristiques non spécifiques du VIH-1 infection et l'inflammation dans les ⁷ SNC. En revanche, la sévérité de la maladie neurologique premortem a été corrélée à la perte de la complexité synaptique, ainsi que le fardeau des macrophages dans le SNC ^8,9,10,11. Cependant, les interactions dynamiques entre la microglie, les macrophages infiltrant périphériques, et les neurones chez les patients atteints MAIN tout simplement ne peuvent pas être modélisés à l'aide conventionnelle de traitement statique obtenue à partir d'études conventionnelles immunocytochimiques. Des études récentes de nos laboratoires ont suggéré qu'au moins certaines de ces interactions entre les périphériques et centraux des cellules mononucléées et les neurones peuvent être modélisés en partie par injection stéréotaxique de la pandémie du VIH-1 dans la protéine Tat _1-72 parenchyme cérébral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, et Gelbard, données non publiées). Nous avons donc décidé d'appliquer in vivo deux imagerie photonique afin d'examiner l'interaction entre les dérivées de monocytes macrophages, les microglies du cerveau et les neurones, dans un modèle de petit animal docile pour NeuroSIDA. Alors que les préparatifs en plein crâne ou éclaircis-crâne se permettre un examen unique de l'architecture corticale pendant une brève période de temps (heures), les enquêteurs s'intéressent à l'évolution temporelle des évènements subaiguë pouvez pas utiliser ces préparations sans artifactually activation des microglies / macrophages due à la manipulation chirurgicale de la la fenêtre crânienne. Ici nous démontrons une manière simple de contourner ces limites en collant un petit morceau de lamelle de verre sur la zone du crâne aminci la prévention de la calotte crânienne de se régénérer dans le TSCW ainsi que le maintien de translucidité pour ≥ 3 semaines. Nous avons également démontré que cette technique nous permet de surveiller le comportement des monocytes périphériques entrer microvascularisation cérébrale ainsi que le cerveau-résident microglie en réaction à l'injection stéréotaxique du VIH Tat _1-72 dans le cortex de souris hétérozygotes pour CX ₃ CR ₁ / GFP ( pour identifier les cellules mononucléées de la lignée). Cette technique peut être facilement adaptée à une utilisation sur des souris avec différentes origines génétiques, par exemple, nous utilisent couramment hétérozygote CX ₃ CR ₁ / GFP X Thy-1 YFP ¹² souris pour étudier les interactions entre les dérivées de monocytes macrophages, les microglies du cerveau et les neurones modèles in vivo de la neuroinflammation pertinentes à la main. Notre préparation TSCW permet aux enquêteurs de l'étude des interactions cellule-cellule entre la périphérie et du SNC qui peuvent survenir sur des périodes de plusieurs semaines, dans lequel l'animal peut être à plusieurs reprises d'image avant et après le traitement expérimental. Ainsi, chaque animal peut servir de son propre contrôle. Une mise en garde pour ce modèle TSCW est que les cellules cibles à l'étude doivent être soit génétiquement pour exprimer des protéines fluorescentes améliorée (eXFP) ou être étiquetés avec un colorant fluorescent, sans rupture mécanique de la calotte crânienne, et que l'expression eXFP doit être suffisamment robuste pour permettent architecture cellulaire pour être visualisées après les séances d'imagerie répétés sur une période de plusieurs semaines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Citrate de fentanyl	Hospira Inc.
Hydrochlorure de midazolam	Baxter Internationl Inc.
Hydrochlorure de médetomidine (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Plaques chauffantes	Beyond Bodi Heat
Pommade ophtalmique à la tobramycine et à la dexaméthasone (TobraDex)	Alcon
Solution à 10 % de povidone-iodé	Betadine Puredue Pharma
Solution à 10 % de chlorure ferrique	Ricca Chemical Company	3120-32
Méthyl cyanoacrylate 910	Permabond
Cyanoacrylate 454	Loctite
Matériau pour prothèse dentaire TEETS, réticulant le méthacrylate de méthyle	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Kits de micromoteur Microtorque II	Pearson Assessments	R14-0002
Forets IRF 007	Fine Science Tools	19008-07
Lame microchirurgicale flexible Norland, à rayon complet	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyanoacrylate	The Original Superglue
Couvre-objet en verre #0	Electron Microscopy Sciences	63750-01
Seringue à volume microscopique de 10 μl	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
Aiguille NanoFil, calibre 35	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Brocheuse à billes, embouts en carbure #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Photomultiplicateur	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Laser à Ti:saphir Mai-Tai	Newport Corp.