La quantification de l'ADN double-brin de brise sur la base de γH2AX foyers est devenu un outil précieux, en particulier dans la radiobiologie, pour l'évaluation de la radiosensibilité des tissus et des effets des rayonnements composés de modification. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers dans des échantillons de tissus.
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Article de méthode
La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'ADN des cassures double brin (CDB) sont des lésions particulièrement meurtrières et génotoxiques, qui peuvent survenir soit par des processus endogènes (physiologique ou pathologique) ou par des facteurs exogènes, en particulier le rayonnement ionisant et les composés radiomimétique. La phosphorylation de l'histone H2A variante, H2AX, à la sérine-139 résidus, dans le très conservé C-terminal motif SQEY, formant γH2AX, est une réponse précoce à l'ADN des cassures double brin
Protocole
Les tissus
- Le tissu pulmonaire, embarqués dans des moules de la température de coupe optimale (PTOM) composé 4583, a été sectionné (5 um) en utilisant un Leica CM 1950 cryostat et montées sur la poly-L-lysine diapositives.
Les échantillons congelés ont été obtenus à partir de Dr Simon Royce à l'enfance Murdoch Research Institute. Le tissu pulmonaire a été obtenu à partir de souris Balb traitées / souris c et à partir d'un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques qui montre de nombreuses caractéristiques pathologiques de l'asthme humain 6. Expériences sur les animaux o....
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Discussion
Aux fins de cette démonstration, nous avons utilisé les tissus pulmonaires de souris Balb traitées à partir / souris c et à partir d'un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques. Nous quantifié les différences dans le nombre de foyers par cellule avec des moyennes légèrement plus élevée observée dans les poumons endommagés par rapport aux sections non traitées. Plus précisément, la quantification indiquée par 6,5 foyers / cellule et 9,4 foyers par / cellulaire (comptage manuel des 20 c.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Le soutien de l'Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l'Australie (566 559). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d'imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail. MMT est reconnaissant pour l'assistance d'experts et de conseils du Dr Olga Sedelnikova du National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Sérum albumine bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | La BSA (1 %) est utilisée pour bloquer toute liaison non spécifique des anticorps. Les anticorps primaires et secondaires sont dilués dans de la BSA. | |
| PBS (sans Ca)2+ et Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Composé OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Lames Polysine | Menzel-Glaser | SF41296SP | Attire électrostatiquement les sections de tissus congelés et réduit le besoin de revêtements ou d'adhésifs supplémentaires. |
| Tween 20 | Réactif | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5 %), est un détergent permettant de perméabiliser les cellules |
| Triton X-100 | Réactif | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0,1 %) utilisé pour la perméabilisation des cellules. |
| Paraformaldéhyde | Réactif | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (anticorps polyclonal de lapin) | Anticorps primaire | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution de l'anticorps primaire (1:500) dans 1 % de BSA. |
| Alexa Fluor 488 anti-lapin IgG (H+L) de chèvre | Anticorps secondaire | Invitrogen | A-11008 | Dilution de l'anticorps secondaire (1:500) dans 1 % de BSA. |
| Éthanol (70 %) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| ARNase A | Réactif | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Réactif | Vector Laboratories | H-1300 | Un milieu de montage à base de glycérine contenant de l'iodure de propidium (un colorant nucléaire rouge). Ce milieu doit être utilisé avec un objectif à immersion huile dont l'indice de réfraction correspond à celui du milieu. Remarque : colorant d'ADN couramment utilisé : le 4,6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI). Ne peut être utilisé qu'avec des microscopes équipés du laser d'excitation approprié. |
| Mini stylo PAP | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Bocal Coplin, en verre | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Bac de coloration | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Microscope confocal | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Logiciel pour l'analyse d'images | Molecular Devices |
Références
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S.
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Réimpressions et autorisations
